新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用     

张利卫  曹贝贝  李炳晓  张云飞  韦学雷  韩丽  胡慧 《中国兽医学报》2018,(4):618-624

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。  相似文献   

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用     

于新友  李天芝 《中国动物检疫》2018,35(4):88-91

为建立猪瘟病毒(CSV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)现场快速鉴别检测方法,参照GenBank中CSV和PRRSV特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测CSV和PRRSV的一步法荧光RT-PCR方法,并验证了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,该方法检测CSV和PRRSV的灵敏度分别可达0.25和1.99 TCID_(50)/100μL,对猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法,可对CSV和PRRSV进行快速诊断,适合现场检测。  相似文献   

Visual Foxpro课程教学方法的探讨与实现     

宋平 《农业网络信息》2011,(6)

对Visual Foxpro课程教学方法进行了探讨,提出了一些切实可行的教学方法,对教学过程中章节、知识点的学习给出了具体的实施方法.为"Visual Foxpro数据库与程序设计"课程教学提供有益的思路和建议,激发学生的学习兴趣,降低学生记忆的难度,增强学生自主学习的信心,从而使学生能够真正地掌握知识,并提高运用所学知识解决实际问题的能力.  相似文献   

猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用     

《畜牧与兽医》2016,(9):50-53

猪δ冠状病毒(PDCo V)是2014年在美国最新检测出的一种猪源冠状病毒。为评估PDCo V在我国的感染和流行情况,根据Gen Bank中登陆的PDCo V M基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,建立了一种基于M基因的猪δ冠状病毒RT-PCR检测方法。研究结果表明,该方法特异性较好,仅对PDCo V有特异性的扩增,对其它主要猪病病毒核酸扩增均呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.33×104拷贝/μL。运用该方法对我国华东地区猪场2014~2015年间的492份临床样品进行检测结果显示,PDCo V总阳性率为2.85%(14/492),其中腹泻样品中阳性率为18.60%(8/43),表明本研究建立的RT-PCR方法可以对临床样品进行有效检测。  相似文献   

治畜病“四不就”     

《当代农业》2014,(18):43-43

一、见热就退烧发热是畜体抵抗疾病的生理保护反应,一定程度的发热可提高细胞吞噬致病微生物的能力,有利于机体的保护。二、见病就抗菌在治疗疾病时,见病就用抗菌药,滥用抗菌药常会引发双重感染,并能造成病菌的抗药性。三、见泻就止痢腹泻是畜体排除腹内毒素及病菌的一种保护反应,但如果腹泻时间过长或过多时,则应急速服补液药品,并应用抗菌药物止泻。  相似文献   

PRRSV、CSFV与SIV三重RT-PCR检测方法的建立     

《畜牧与兽医》2015,(10):109-111

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)与猪流感病毒(SIV)三重RT-PCR方法,根据Gen Bank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的RT-PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364 bp(PRRSV)、530 bp(CSFV)和981 bp(SIV)。通过试验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PRRSV、CSFV和SIV的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-2、8.3×10-2和3.7×10-2ng。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有力手段。  相似文献   

种猪场猪瘟的控制与净化     

王亚波 《养殖技术顾问》2014,(3):204-204

猪瘟是猪瘟病毒（CSFV）引起的一种猪的急性、烈性、接触性传染病，在我国被列为一类传染病，国际动物卫生组织将列为其A类动物传染病。长期以来，猪瘟多以非典型性、慢性及隐性形式出现，给养猪业造成巨大的经济损失。在规模化猪场猪瘟控制与净化过程中，我们采取接种免疫疫苗为主的方法，并配有特异、敏感、便于操作的检测、监测手段，应用猪瘟病毒RT-PCR方法进行初筛，如有阳性，再进行猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR方法鉴别检测，若出现阳性，则进行扑杀。这一套猪瘟净化技术措施的实施在猪瘟净化过程中取得了较好的净化效果。  相似文献   

论农民工的双重生活与市民化     

《农村经济与科技》2017,(1):194-196

从涂尔干的社会团结理论出发分析中国农民工特有的双重生活,接着提出农民工市民化过程中遭遇的几个文化方面的阻碍,并尝试用马克思关于人的全面发展的观点对农民工市民化的可能性提出一些看法和建议。  相似文献   

陕西杨凌某蛋鸡场禽戊型肝炎病毒的检测     

拓晓玲  刘宝元  陈宜阳  孙亚妮  赵钦  周恩民 《动物医学进展》2017,38(7)

2014年-2015年陕西杨凌地区部分商品蛋鸡场产蛋量下降了10%~40%,剖检部分鸡只发现肝脏肿大出血。为确诊该疫情的病因,从发病的6个蛋鸡场采集了337份血清和268份粪便,利用间接ELISA和套式RT-PCR分别对血清中的禽戊型肝炎病毒(HEV)抗体和粪便中的禽HEV RNA进行了实验室检测。ELISA检测结果发现,168份血清为禽HEV抗体阳性,阳性率为49.85%;套式RT-PCR检测结果发现,63份粪便为禽HEV RNA基因片段阳性,阳性率为23.51%。基因片段的序列同源性分析发现,杨凌地区的禽HEV分离株与国内的同源性为93.0%~99.2%;进化树分析表明,其与国内其他地区的分离株在同一进化分支上,同属禽HEV基因3型。  相似文献   

H7亚型禽流感病毒核酸标准品制备及双探针荧光RT-PCR检测研究     

《中国兽医杂志》2014,(11)

从禽流感病毒A/Chicken/1/2002(H7N1)核酸中扩增了完整HA的基因编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备c RNA。用RNA保存液稀释至含量约108Copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过8家实验室联合定值,取平均值作为定值结果;经统计分析计算了该标准品的不确定度。此外,采用Taq Man方法,根据禽流感病毒H7亚型的血凝素基因的末端,采用1对引物和2条MGB探针,建立了禽流感病毒H7亚型Taq Man荧光RT-PCR快速检测技术。应用建立的方法对研制的标准品进行检测,检测限可达10基因拷贝;对新城疫病毒及其他亚型的流感病毒核酸进行检测,结果表明,建立的方法特异性良好,而且双探针的设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。  相似文献