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[目的]优化1种猪细环病毒2型(TTSuV2)的荧光定量PCR检测方法.[方法]对原有引物进行调整设计,以原有重组质粒为模板来重新进行检测TTSuV2 DNA的SYBR Green Ⅰ real-time PCR扩增.[结果]新的TTSuV2 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为99.3％,标准曲线的决定系数为0.998,可准确检测的最低核酸模板浓度为50 copies/μL.与原方法相比较,新方法在熔解曲线、特异性、重复性方面都非常接近,但在扩增曲线方面得到明显改善,其可准确定量检测的灵敏度提高了至少10倍以上,临床检测数据也更加准确可靠.[结论]建立了一种新的准确灵敏度更高的定量检测TTSuV2的荧光定量PCR方法. 相似文献
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选择合适的内参基因是采用实时定量PCR研究基因表达获得可信数据的关键。以小麦在条锈病菌及温度双因素胁迫为研究对象,采用实时荧光定量PCR评价了CDC、RLI、ACTIN和26S基因的表达情况,采用geNorm和NormFinder软件进行了比较分析。结果表明,小偃6号小麦在常温(15℃±1℃)未接种条锈病菌,以及接种条锈病菌并培育至花斑期分别在高温(20℃±1℃)、变温(20℃到15℃)条件处理中,基因RLI表达不稳定,基因ACTIN在常温条件下以及在条锈病菌及高温处理条件下的表达量相对稳定,但在变温条件下波动较大。表达最稳定的基因是26S,其次是CDC基因,它们可以作为小偃6号-CYR32-温度互作体系中基因表达实时荧光定量PCR研究的内参基因,26S和CDC是最佳内参基因组合。 相似文献
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转基因抗虫玉米的定量检测 总被引：1，自引：1，他引：0
建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为：3.13%、1.09%、0.53%（SYBR Green I法）和3.07%、1.02%、0.50%（Taqman探针法）,RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。 相似文献
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猪细小病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。 相似文献
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猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已发表的HCV 5’NTR核苷酸序列设计一对特异性引物,扩增位置在整个基因的221～377位,片段长度为167bp。提取由厦门出入境检验检疫局技术中心动物实验室保存的HCV细胞毒的RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBR Green I实时定量PCR检测猪瘟病毒的方法,并用该方法检测送检的临床疑似病料。结果表明：本研究建立的HCV-SYBR Green I PCR特异性强,与FMDV、PCV2、PRRSV、PPV、PRV等常见猪病毒病病原没有交叉反应;灵敏度高,可以检测到5．3×10^2的病毒拷贝数;操作简单,耗时短,只需3h即可完成整个试验过程,可初步用于临床检测。 相似文献
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叶用莴苣荧光定量PCR体系的优化 总被引：1，自引：1，他引：0
为建立一套最适合叶用莴苣(Lactuca sativa L.)基因表达量研究的荧光定量PCR技术体系,以叶用莴苣S24为试材,采用SYBR GreenⅠ法,利用叶用莴苣内参基因的2对引物组合18SR1和18SR2,分别在10 μL和20 μL反应体系条件下进行扩增反应。结果表明,分别在10 μL和20 μL反应体系条件下内参基因引物组合18SR1的扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线等指标都优于内参基因引物组合18SR2;2对内参基因引物组合18SR1和18SR2在10 μL反应体系中的扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线等指标也均优于20 μL反应体系。因此叶用莴苣荧光定量PCR内参基因利用18SR1引物组合,反应体系采用10 μL比较合理。 相似文献
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【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。 相似文献
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1—2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA转录水平的相对定量研究 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。 相似文献
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SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。 相似文献