实时荧光定量PCR筛选牛源整联蛋白αv基因的siRNA片段     

张国峰  独军政  常惠芸  薛霜  骆继怀 《动物医学进展》2011,32(3):56-60

设计并合成三条针对牛口蹄疫病毒(FMDV)整联蛋白受体αv亚基基因的特异性干扰小RNA(SiRNA)片段,将其转染至本身表达整联蛋白受体αv亚基基因的MDBK细胞.分别在转染后36 h和48 h收集细胞,提取细胞总RNA并反转录为cDNA.应用SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR的方法检测3个siRNA片段的...  相似文献   

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

于江  吴家强  张玉玉  王兆  李俊  丁鹏  李坤  刘洋  张金强  徐绍建  刘少宁  周顺  王文志  王金宝 《家畜生态学报》2010,31(4)

根据GenBank中的副猪嗜血杆菌(HPS)的infB基因的序列(DQ781808.1),利用分子生物学软件Premier 5.0设计一对特异性引物,建立基于SYBR Green I 荧光定量PCR检测HPS的技术.试验采用煮沸法从HPS培养物中提取DNA,进行PCR扩增.将鉴定正确的目的基因片段克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为阳性标准品.结果表明,该方法对HPS具有良好的特异性,不与其它猪源细菌发生交叉反应,其敏感性比常规PCR高100倍,而且非常稳定,批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%.临床应用表明本方法的建立实现了对HPS的快速诊断和定量的检测.  相似文献   

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立     

施开创  莫胜兰  许瑞胜  李向涛  陈宏备  郑敏  刘棋 《中国畜牧兽医》2010,37(7):74-79

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。  相似文献   

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因     

王芳  赵献军  雷萌桐  白东宁  王大会  齐雪峰 《西北农业学报》2011,20(12):6-10

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。  相似文献   

转基因水稻深加工产品两种荧光定量方法的比较研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

敖金霞  高学军  权东升  徐迪  于艳波  李璐  袁肖寒 《东北农业大学学报》2011,42(1):34-39

根据转基因水稻中外源基因Cry1A(B)和内源基因SPS设计SYBR Green I引物、TaqMan引物和荧光探针,以内源基因SPS作为内参照,使用两种FQ-PCR方法对水稻深加工产品中转基因水稻的含量进行定量检测.建立了转基因水稻标准品Cry1A(B)和SPS之间的△Ct与样品中转基因水稻含量百分比之间的校正曲线和...  相似文献   

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数   总被引：1，自引：0，他引：1  

冀志庚  高学军  敖金霞  张明辉  霍楠 《东北农业大学学报》2011,42(10):11-15

采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x...  相似文献   

土壤大丽轮枝菌微菌核的快速定量检测   总被引：4，自引：0，他引：4  

魏锋  余真真  商文静  杨家荣  徐向明  胡小平 《植物病理学报》2013,43(5):449-457

 微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染来源。对土壤中大丽轮枝菌微菌核进行定量是黄萎病监测和预警的基础。本研究以大丽轮枝菌Internal Transcribed Spacer (ITS)区特异性引物对P1/P2扩增产物的重组质粒为标准品,构建SYBR Green I实时荧光定量PCR反应的标准曲线,结合土样水筛法建立了土壤大丽轮枝菌微菌核定量检测体系。同时,建立了土壤中微菌核数量与棉花黄萎病发病率的关系模型。结果表明,实时定量PCR检测灵敏度比常规PCR高10倍,检测下限为1个微菌核/克土,在5.54×10²～5.54×10⁷copies范围内,DNA拷贝数的对数值与Ct值具有良好的线性关系。建立的土壤中微菌核个数n与Ct值之间的关系为n=e^7.3-Ct/3.905。温室人工接种微菌核数量与棉花黄萎病发病率间的线性关系为y=2.710n+0.251。  相似文献   

鰤鱼诺卡氏菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用   总被引：2，自引：0，他引：2  

王国良  刘璐  李思源 《水产学报》2012,36(4):509-513

根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于蛳鱼类致病鱼诺卡氏菌的快速检测。  相似文献   

应用多重SYBR Green-I实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒     

王洪星  张雨良  王健华  章绍延  熊国如  刘志昕 《热带作物学报》2012,32(7):52-56

基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量 PCR(real time-quantitative,RT-qPCR）检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重 SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.  相似文献   

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立   总被引：2，自引：2，他引：0  

周云雷  魏飞龙  李健  张小华  蒋红霞 《中国农业科学》2011,44(11):2371-2378

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。  相似文献