用生物素标记外壳蛋白基因cDNA探针检测葡萄扇叶及马铃薯Y病毒   总被引：6，自引：0，他引：6  

魏梅生  王晋芳 《植物病理学报》1995,25(4):331-334

 以葡萄扇叶病毒(GFV)干u马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的重组质粒为模板,用聚合酶链式反膨技术(PCR)分别合成了长度为1.5kb和0.75kb的生物素标记双链cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针的最适使用浓度为1/100,GFV探针检测GFV-RNA的灵敏度为10pg,检测提纯GFV的灵敏度为25pg,检测感病苋色藜的最大稀释倍数为10000倍;PVY探针检测PVY-RNA的灵敏度为30pg,检测提纯PVY灵敏度为500pg,感病烟草检测的最大稀释度为8000倍,阴性对照均无杂交信号出现。  相似文献   

Development of multidrug resistance in a canine lymphoma cell line   总被引：1，自引：0，他引：1  

Uozurmi K  Nakaichi M  Yamamoto Y  Une S  Taura Y 《Research in veterinary science》2005,78(3):217-224

New multidrug resistant cell lines developed from the canine B cell lymphoma cell line (GL-1) were characterized in terms of chemosensitivity to some antineoplastics and P-glycoprotein (Pgp) expression. GL-1 was continuously exposed to a culture medium containing gradually increasing levels of doxorubicin and the cells that could grow in the presence of doxorubicin were obtained. Chemosensitivity of these cells to various antineoplastics were investigated with or without verapamil, which reversed Pgp-mediated drug resistance. The expression of Pgp on the cells was also examined by Western blot analysis. As a result, three kinds of resistant cell lines, designated as GL-DOX60, 300, and 4000 were obtained. These cell lines showed stable proliferation in the medium containing 60, 300, and 4000 ng/ml, respectively. These cells were much more resistant to vincristine than doxorubicin. This resistance was strongly reversed by the presence of verapamil. On the other hand, cisplatin was effective enough in killing these derived cells. In the Western Blot analysis, some bands that reacted to the anti-human Pgp monoclonal antibodies were observed in GL-DOX4000. The cells derived from GL-1 have multidrug resistance potential mediated by canine Pgp. The cells produced in this experimental trial are considered to be useful models for various investigations on canine multidrug resistance.  相似文献   

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引：2，自引：1，他引：2  

李广存  杨煜  王秀丽  杨元军  毕玉平 《园艺学报》2004,31(4):517-519

 以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒s(PVS)总RNA为模板，通过RT—PCR获取长度为890 bp的P 一cp的cDNA，克隆至pGEM—T载体上。酶切回收该基因片段，并构建了该基因的原核表达质粒pBV—pvs。SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明：P 一印基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白，且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔，获得的抗血清可用于大田马铃薯s病毒的快速检测。  相似文献   

含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究   总被引：2，自引：1，他引：2  

姜永萍  李呈军  张洪波  步志高  张芳芳  邓国华  于康震  陈化兰 《中国预防兽医学报》2005,27(6):441-444,449

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白的基因optiHA5,并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA5,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA5和pCIoptiHA5分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24～48h293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Westemblot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA5体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.  相似文献   

犬瘟热病毒Yunnan株H基因的克隆与表达     

聂福平  李作生  邱薇  张富强  张连江  宋贵强  龙贵伟  廖金  任玉莹  余方芳  张泉鹏  王灵强  范泉水 《动物医学进展》2008,29(1):9-12

根据已发表的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株的序列设计两对引物,以犬瘟热病毒云南株感染的Vero细胞收获病毒提取的总RNA为模板,RT-PCR扩增出H基因的939 bp(H基因前段,H1)和920 bp(H基因后段,H2)片段,分别将其定向克隆于PET-28a( )中,将重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)plysS,在35℃1、.0 mmol/L IPTG诱导下获得良好表达,经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白为34 ku,与预期大小一致。免疫印迹试验显示,该重组蛋白可被CDV Onderstepoort株多克隆抗体识别,表明该重组蛋白具有抗原性。  相似文献   

水稻HL-CMS细胞质雄性不育基因的体外转录及Northern Blot检测     

华宇峰  刘京  王春台等 《安徽农业科学》2014,(12):3497-3498,3501

[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,为Northern Blot检测提供阳性定量标准品,并可作为凝胶阻滞试验的底物,用于研究与恢复基因编码产物的相互作用,从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物,利用不育系YTA为材料,PCR扩增获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,补平粘性末端,以rN4为底物、用依赖于DNA的RNA聚合酶进行体外转录,转录产物用DNase处理除去DNA模板,纯化并测定RNA浓度,并用Northern Blot验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,经检测orf216浓度为1.286μg/μl,A260/A280为2.01;orfH79浓度为1.006μg/μl,A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一,纯度较高,可用于体外大量获取目的 RNA。  相似文献   

棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的原核表达和orf99敲除回复子的构建     

钱丽莹  闫尧  曾利平  徐旭士 《安徽农业科学》2010,38(20):10543-10546,10574

[目的]探索棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的最佳表达条件。[方法]采用PCR从其基因组中扩增出orf99编码区,将其克隆到pGEM-Teasy载体,测序后将其亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,转化大肠杆菌BL21加入IPTG诱导融合表达。并在orf99缺失杆粒HaBac△99的基础上构建了orf99敲除子HaBac-KO99及回复子HaBac-Rep99。[结果]SDS-PAGE分析表明,GST-Ha99融合蛋白得到成功表达,Westernblot进一步分析表明融合蛋白已得到成功表达。此外,PCR及酶切验证各载体构建成功。[结论]为orf99功能的进一步研究奠定基础。  相似文献   

蘑菇黑斑病病原菌分离与鉴定   总被引：2，自引：0，他引：2  

陈少珍  黄思良  黄卓忠  闭志强 《广西农业科学》2009,40(1):43-46

以广西横县云表镇病蘑菇作为分离材料,通过室内分离培养与田间（棚内）接种,获得对蘑菇有致病性的黑根霉菌。对黑根霉菌的形态特征观察结果表明,病菌孢囊梗大小为984．7-1798．6（1179．9）μm×13．0-29．1（22．8）μm,孢子囊球形或近球形,直径为87．5～208．4（140．5）μm,孢囊孢子球形或近球形或椭圆形或不规则形,大小为6．1-12．2（9．3）μm×5．6-11．3（7．8）μm;致病性测定结果表明,所分离的黑根霉菌是蘑菇黑斑病的病原真菌。  相似文献   

我国苜蓿褐斑病研究进展   总被引：8，自引：0，他引：8  

桂枝  高建明  袁庆华 《天津农学院学报》2002,9(4):37-41

苜蓿是农牧业发展中不可缺少的牧草之一。苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌引起的一种最常见的世界性豆科牧草病害,对它的研究多数集中于褐斑病的田间病情调查与病原菌的鉴定。近年来,由于生物技术的迅速发展,国内的研究者开始对褐斑病进行一些比较深入的研究,本文对苜蓿褐斑病的研究进展做一介绍,不仅指出了存在的问题,同时还提出了一些建议,以供我国有关的科技人员和生产参考。  相似文献   

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布   总被引：1，自引：0，他引：1  

朱建中  陆承平 《南京农业大学学报》2002,25(3):75-79

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。  相似文献