大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析     

宋阳  王丕武  张学明 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2014,42(10):63-69,80

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。  相似文献   

文冠果人工林根际土壤真菌和根系内生真菌群落多样性1）     

朱琳  黄建  陈天阳  周永斌 《东北林业大学学报》2015,(5):105-111

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）根际土壤和根系内生真菌的多样性与土壤养分变化具有相关性。以人工文冠果林为研究对象,采集根际土壤和细根并提取DNA,采用Illumina Miseq高通量测序技术分析真菌rDNA的ITS1区域,同时测定了根际土壤的N、P和有机质等因子,以分析文冠果林根际土壤真菌和根系共生真菌与环境因子的关系。结果表明：①测序共获得clean reads有238．8104万个（土壤209．2113万个,根系295．9910万个）;在97％的相似度水平下,共获得1115个操作分类单元（ OTUs）：根际土壤真菌1028个,根系共生真菌514个,其中有59个OTUs鉴定为菌根真菌。在10～12年生林中,病原真菌数量较高,主要为镰刀菌属（ Fusa rium）、链格孢属（ Atl ernaria）及青霉属（ Penicillium）,可能与林地土壤肥力退化有关。②不同林龄文冠果根际土壤理化性质差异显著,1～2年生林土壤肥力较高,全氮、速效氮、全磷、速效磷质量分数分别为110．00、345．6、230．00、5．18 mg· kg－1,均高于5～7年生林和10～12年生林。随土壤肥力降低根内真菌OTUs个数递减。③1～2年生林根际土壤和根系内生真菌丰富度指数Chao1、均匀度指数ACE均最高。真菌群落多样性指数Simpson与全氮、速效磷质量分数呈正相关关系。可见,不同林龄文冠果人工林真菌群落存在差异,文冠果根际真菌群落与土壤环境因子之间具有相关性。  相似文献   

西甜瓜根际真菌种类的研究     

蒋萍  赵震宇  王叶筠 《新疆农业大学学报》1995,(2)

本文对西甜瓜从播种到收获及采收后的根际真菌进行了分离，共得分离物一千零二十一号菌编，然后对这些分离物进行了鉴定，并统计了它们在西甜瓜整个生长期及收获后的出现频率。结果表明：西甜瓜根际真菌种类有青霉、曲霉、根霉、毛霉、交链孢霉、木霉、立枯丝核菌、腐霉、疫霉、菜豆壳球孢。其中，毛霉、交链孢、镰孢霉在西甜瓜整个生长期及收获后都有出现，青霉、曲霉、根霉分离出现频率也很高，而立枯丝核菌、菜豆壳球孢、腐霉、疫霉、木霉只出现在西甜瓜生长的某个或某几个时期，且分离比例较小。  相似文献   

拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析          下载免费PDF全文

张秀春  吴坤鑫  孙建波  夏亦荠  彭明  李文彬 《热带生物学报》2012,3(2):116-120

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT2上游非编码区,并将其与pBAR－GUS3相连,构建了植物表达载体pNUD12P－GUS,采用以农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株（2周幼苗）进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3．5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT2启动子,且该启动子为组成型表达启动子;病原菌Pst．DC3000及风t．DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。  相似文献   

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立     

蒲艳  刘超  李继洋  阿尔祖古丽·塔什  胡燕  刘晓东 《中国农业科学》2018,51(2):315-326

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。  相似文献   

cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析     

刘明  孙海燕  高继国 《东北农业大学学报》2017,48(9)

苏云金芽胞杆菌cry基因启动子常用于构建蛋白表达载体。为探讨苏云金芽胞杆菌cry基因启动子指导Vip3Aa蛋白表达情况及杀虫活性,以p UC19载体为基础,运用重叠引物PCR方法构建Vip3Aa11表达载体,并与由T7启动子指导的Vip3Aa11表达蛋白杀虫活性、抗胰蛋白酶稳定性比较,初步探索发酵条件。结果表明,cry1Ac启动子与T7启动子均在上清液中表达大小为88 ku Vip3Aa11蛋白,对甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性差异不显著,cry1Ac基因启动子在37℃、48 h更适合Vip3Aa11蛋白的表达,为vip基因表达、功能验证及杀虫机理等研究提供新思路。  相似文献   

小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌群落结构的影响     

田晴  高丹美  李慧  刘守伟  周新刚  吴凤芝 《中国农业科学》2020,53(5):1018-1028

【目的】研究小麦根系分泌物对西瓜连作土壤中特异性菌群、真菌群落结构和多样性的影响,明确根系分泌物对改善连作土壤微生物环境的作用,为西瓜枯萎病的生态防治和菜田土壤的健康保持提供参考。【方法】本试验以连作3年的西瓜土壤为研究对象,利用土培盆栽试验研究小麦根系分泌物对西瓜连作土壤中真菌群落结构和多样性的影响。【结果】荧光定量结果表明外源添加小麦根系分泌物降低了土壤中总真菌、尖孢镰刀菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度,增加了木霉菌的菌群丰度,且有西瓜苗并添加小麦根系分泌物处理的木霉菌丰度最高,尖孢镰刀菌的丰度最低。无西瓜苗并添加去离子水溶液处理的木霉菌丰度最低,尖孢镰刀菌的丰度最高。在门水平,增加了西瓜连作土壤中壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度,降低了接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度;在属水平,增加了对病原菌有拮抗作用的毛壳菌属（Chaetomium spp.）和顶孢霉属（Acremonium spp.）的相对丰度,同时降低了有致病潜力的尖孢镰刀菌属（Fusarium spp.）和腐生菌（Humicola spp.）物种的相对丰度。【结论】小麦根系分泌物引起的西瓜连作土壤中真菌群落的变化是小麦间作西瓜减缓西瓜病害的原因之一。  相似文献   

不同连作年限菊花根际土壤微生物多样性变化特征     

张晓波  于春雷  张文洋  闫烨  阮芳 《浙江农业学报》2022,34(12):2710

为揭示连作菊花根际土壤微生物群落结构和多样性变化特征,以不同连作年限菊花根际土壤为试验材料,采用高通量测序技术(Illumina-MiSeq)和生物信息学方法,分析无连作(CK)、连作2年(2a)、连作9年(9a)菊花根际土壤细菌和真菌的丰富度、多样性指数和群落结构,以期为菊花连作障碍防控提供理论支撑。结果表明,2a、9a根际土壤细菌数量和多样性较CK显著(P<0.05)增加,2a和9a的群落结构相似,共有OTU(operational taxonomic unit)比例高。连作对菊花根际土壤真菌群落多样性和丰度影响较小,但对真菌群落组成影响显著,2a、9a根际土壤真菌接合菌门、担子菌门和被孢霉属等群落丰度减少,明梭孢属、镰刀菌属、土赤壳菌等群落丰度增加。菊花连作会显著增加其根际土壤细菌数量和多样性,显著影响真菌群落结构组成。  相似文献   

rbcS启动子的克隆及活性鉴定   总被引：2，自引：0，他引：2  

王旺田  张金文  刘玲玲  陈正华 《甘肃农业大学学报》2004,39(3):255-260

利用PCR技术从豌豆(Pisum satium Linn)基因组DNA中分离了rbcS基因启动子及叶绿体定位信号编码序列。序列分析表明,扩增片段(1256bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41 %。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片及洋葱表皮细胞。结果表明这一表达系统增强了绿色荧光蛋白基因的瞬时表达,从而为外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具,可以实现目的基因的组织特异性和光诱导性表达。  相似文献   

一种免疫诱导型鲤启动子的克隆与功能分析     

赵紫霞  张研  曹顶臣  孙昭宁  许建  徐鹏 《水产学报》2017,41(12):1829-1837

为发掘适用于基因工程抗病育种的鱼类启动子,通过实时荧光定量PCR实验对鲤Rab GTP酶(Ras-associated binding-GTPases 1a3,Rab1a3)基因的表达模式进行了分析,证实该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录水平较高,且免疫激活后转录显著增强,符合基因工程抗病育种所需的外源免疫基因转录模式。从鲤细菌人工染色体文库中,使用Rab1a3基因特异引物筛选获得包含该基因区域的文库克隆,测序获得该基因完整序列,以及上下游调控序列。通过生物信息学手段,预测到长度为1014 bp的鲤Rab1a3基因启动子序列,该启动子不具有典型的TATA盒或CpG岛特征,存在多个免疫相关转录因子结合位点。在草鱼肾组织细胞系内验证该启动子活性,结果显示,绿色荧光蛋白基因和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,证实该片段具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,双荧光素酶报告基因检测结果显示,该启动子活性在免疫刺激后增强至免疫刺激前的8.67倍。研究表明,鲤Rab1a3基因启动子有望被开发成为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。  相似文献