伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究     

常雯茹  段利芳  杨乐  马英先  王棋  翟云云  周鲁豫  张爽  明胜利  杨国宇  王江  褚贝贝 《中国畜牧兽医》2021,(1)

试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。  相似文献   

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究     

常雯茹  段利芳  杨乐  马英先  王棋  翟云云  周鲁豫  张爽  明胜利  杨国宇  王江  褚贝贝 《中国畜牧兽医》2021,48(1):83-92

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。  相似文献   

母猪不发情的常见原因与对策     

耿稷  顾林 《吉林畜牧兽医》2021,42(1)

母猪不发情是多方面引起的,原因很复杂,本文作者归纳了母猪不发情的常见原因和应对策略。1母猪不发情的常见原因分析1.1母猪因病致不发情母猪本身身体素质不佳,因患有疾病致其不发情。常见致母猪不发情的疾病,主要有细菌病、慢性消化系统疾病、病毒病、呼吸系统疾病、衣原体隐性感染、寄生虫病等都可能会对母猪的生殖器官产生危害,导致其不发情。如猪瘟、细小病毒病、伪狂犬病、乙型脑炎等可能会使得母猪出现子宫内膜炎、阴道炎以及子宫炎等,使得母猪不发情。再比如说,呼吸系统疾病、寄生虫病等会引发母猪激素分泌不足,卵巢发育不良,影响母猪发情。衣原体隐性感染,则将会引发母猪生殖道炎症,母猪可能会因此不排卵或者是排卵不孕。  相似文献   

猪伪狂犬病的流行病学、临床症状及防控措施     

崔煜坤  李相安  李克鑫  佟庆东  李开凯  张平  牛绪东  刘建柱 《猪业科学》2021,38(2):101-104

猪伪狂犬病由伪狂犬病毒引起,临床上以妊娠母猪流产、产死胎,新生仔猪出现共济失调、神经症状,并造成仔猪大量死亡为特征。自伪狂犬病毒毒株变异以来,病猪数量不断增加,严重威胁了养猪业健康发展,并造成巨大的经济损失。文章将从流行病学、临床症状、病理变化、鉴别诊断、防控措施等几个方面对猪伪狂犬病进行概述,希望能够对猪伪狂犬病的防控、净化提供帮助。  相似文献   

伪狂犬病毒表达载体的研究进展     

赵军  黄剑波  朱玲  徐志文 《猪业科学》2016,(2):102-105

随着生物工程技术的逐步发展和完善,利用伪狂犬病毒作为载体的相关研究也取得了一定突破,为后续的伪狂犬基因工程疫苗研制奠定了基础。文中以缺失处理相关基因的伪狂犬病毒作为载体,与构建的携带外源基因的质粒在细胞内同源重组的研究现状进行了综述。  相似文献   

某规模化猪场血清学检测结果分析     

徐丹  张迪  吴婷婷  徐秀彬 《猪业科学》2016,(12):68-70

血清学检测,是猪场最广泛使用的检测方法之一。本案例中,笔者对江苏某猪场送检的193份血清样进行了猪瘟抗体、猪伪狂犬g B/g E抗体、猪圆环病毒抗体、猪蓝耳病毒抗体的检测和分析。结果显示该场后备母猪猪瘟免疫欠佳,猪伪狂犬病免疫不合格,猪蓝耳病抗体水平偏高;母猪猪伪狂犬病毒感染程度较高,猪呼吸与繁殖综合征普遍感染且抗体偏高;公猪猪圆环病毒抗体水平偏高;商品猪猪瘟免疫效果不稳定;猪蓝耳病感染比较普遍,且部分猪群抗体水平偏高,猪圆环病毒病免疫欠佳。结合该场免疫程序,表明该场后备母猪和商品猪的猪瘟、猪伪狂犬病免疫程序需要做适当调整;同时考虑通过测序了解本场的猪蓝耳病流行毒株,以确定合适的防控方案。  相似文献   

关于猪伪狂犬病防治的探讨     

张秀丽 《甘肃畜牧兽医》2016,(16)

猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又称Aujeszky氏病,是由伪狂犬病病毒引起多种家畜的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的高度接触性传染病。仔猪和其他易感动物一旦感染该病,死亡率极高,常给养猪业造成巨大的经济损失。文章介绍了猪伪狂犬病的临床症状、病理变化及诊断方法,并提出了具体的防治措施,以供同行参考。  相似文献   

猪伪狂犬病的诊治     

郑春华  詹耀芳  杨力平 《兽医导刊》2016,(10)

近几年来,猪伪犬病已成为全球危害养猪业最严重的传染病之一,在我国,随着规模化养殖业的发展,该病在不少地区养猪场爆发流行,造成养猪生产中严重的经济损失.结合本人的实践经验,谈谈猪伪狂犬病认识.  相似文献   

闽西地区猪伪狂犬病病毒变异株gC基因克隆与序列分析     

《中国兽医杂志》2016,(1)

为了解闽西地区2013年以来猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集了闽西不同地区的14株PRV分离株,并对其gC基因进行遗传变异分析。结果表明,14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的核苷酸序列同源性为98.8%~99.7%,而与Bartha疫苗株核苷酸序列同源性为93.6%~93.8%。氨基酸多序列比对发现,14株PRV分离株和近年来国内分离的PRV毒株gC基因氨基酸序列同源性较高,有很多相同的特征性氨基酸替换,其中最有特征性的是aa52~aa61,aa63~aa69位和aa186~aa194位氨基酸的替换和插入。遗传进化树分析表明,14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV株位于一个相对独立的大分支中,且形成了一个独立的亚分支,而与Bartha疫苗株存在很大差异,亲缘关系较远。抗原表位预测分析表明,PRV闽西分离株与Bartha疫苗株相比发生了抗原漂移,该差异是否预示闽西地区流行株正在向远离疫苗株的方向变异尚有待进一步研究。  相似文献   

一起绵羊伪狂犬病的发生及病毒gE基因的序列变异分析     

《中国兽医杂志》2016,(4)

为了确诊一起绵羊伪狂犬病的发生,采集送检病羊的皮肤、脾脏、淋巴结、脑等组织器官进行实验室病毒分离和PCR检测。结果显示,病料中扩增出了伪狂犬病病毒的特异性g E基因片段。结合流行病学调查、病理剖检和实验室诊断,确定引起此次疫情的病原为伪狂犬病病毒。为了进一步了解此次疫情中PRV g E基因的分子特征,特对PCR扩增产物进行了连接、转化和测序分析。遗传进化分析表明,该分离株与亚洲各分离株处于同一分支,基因同源性高达98.4%-99.4%,与欧洲、美洲分离株同源性相对较远,分别为97.0%-97.2%、97.2%-97.3%;g E蛋白氨基酸序列分析显示,该分离株在g E蛋白的第48位和第492位各存在1个天冬氨酸的插入,与我国当前流行的伪狂犬变异株相同,同时在当前猪伪狂犬病病毒变异株基础上又出现了新氨基酸位点的变异,如L49P、P160T、V406G、G445R,其分子生物学特性有待进一步的研究。本文通过综合诊断确定该病由伪狂犬病病毒引起,为我国绵羊伪狂犬病的流行病学分析及防控提供了重要的理论依据。  相似文献