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101.
为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25~48、55~63、92~106、113~124、139~147、170~189和195~205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。 相似文献
102.
应用聚全酶链反应(PCR)对畜型和禽型两个融合基因HBsAg/LHRH的5’端分别作了改造,切去了融合基因起始密码ATG前一段非编码序列61个碱基,将改造后的融合基因插入pBluescripe 11 KS^+质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含T7Promoter强启动子的表达载体pET15b中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在E.coliDE 相似文献
103.
【目的】将玉米异分支酸合成酶1(ZmICS1)及系统获得抗性缺陷1(ZmSARD1)进行原核表达和纯化,并免疫家兔获得多克隆抗体,为深入研究ZmICS1和ZmSARD1在玉米抵抗病原菌胁迫中的功能奠定基础。【方法】克隆玉米ZmICS1和ZmSARD1基因CDS区,连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白,以透析纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并进行验证和检测。【结果】成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,于37 ℃、0.84 mmol/L IPTG在大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2(DE3)中诱导出His×6-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白。纯化蛋白免疫家兔,所得ZmICS1抗体能够检测到3 ng的His×6-ZmICS1,ZmSARD1抗体能检测到低至0.3 ng的His×6-ZmSARD,且分别能特异性地检测玉米B73原生质体过表达的ZmICS1和ZmSARD1蛋白。【结论】成功制备了玉米ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体,可用于玉米内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白含量的检测。 相似文献
104.
山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊GST-Sox2融合蛋白.用RT-PCR方法从山羊(Capra hircus)肠组织克隆了c-Myc基因,通过TA克隆,构建了pMD18-T-Myc质粒.DNA测序证明,山羊c-Myc全长cDNA约1320 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框,编码439个氨基酸,经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的c-Myc序列同源性为99.2%.将该cDNA片段亚克隆至pGEX-KG载体,构建了重组质粒pGEX-KG-Myc.经酶切鉴定和测序,将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,由IPTG诱导表达,以谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化GST-Myc融合蛋白.SDS-PAGE分析表明,纯化的GST-Myc融合蛋白约75 kD,与预期值相符,且呈现清晰的单一条带.Western blot检测证实,该融合蛋白能够被GST抗体所识别.本实验克隆了山羊c-Myc基因,获得了高纯度的GST-Myc融合蛋白,为其多克隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料,为山羊iPS细胞(induced pluripotent stem cells)检测创造了条件. 相似文献
105.
采用大田试验,研究等氮水平下不同肥料、分配方式及与磷、钾配施对夏玉米植株氮磷钾和土壤速效氮磷钾含量及产量的影响。结果表明:在常规施氮(底施和大口追施)、常规优化施氮(底施和大口、吐丝2 次追施)和控释氮素配施2 种磷钾水平用量(P2O5 105-K2O 120 kg/hm2和P2O5 157.5-K2O 180 kg/hm2)组合中,各处理大口期前植株干质量、氮磷钾含量、氮磷钾累积量以常规施氮高于控释尿素;成熟期穗粒数、千粒重和产量以控释尿素处理高于常规优化施氮处理,后者又高于常规施氮处理。等氮处理下,增施磷钾提高了植株磷、钾含量和累积量,植株含氮和氮累积量明显增加。各处理土壤速效氮、磷含量随生育进程不断降低,速效钾含量表现为“V”字型特征;土壤速效养分与植株养分含量表现趋势相反,生育后期控释尿素低于常规优化施氮,后者又低于常规处理。增施磷钾明显提高各时期土壤速效磷、钾含量,但使土壤氮含量降低。与对照相比,各处理单位氮、磷、钾生产籽粒能力降低;各处理中,单位养分生产籽粒以常规施氮高于常规优化施氮,后者又高于控释尿素。肥料养分利用率以控释尿素处理最高,其次为常规优化施氮,常规施氮最低。表明与常规施氮相比,控释尿素结合磷钾底施,能协调生育期间养分供应,改善植株中后期氮磷钾吸收、积累和物质生产,是改善养分利用效率、穗部性状和产量的优化施肥技术。 相似文献
106.
为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。 相似文献
107.
类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs) 作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK 信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230~439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E. coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 kDa位置出现与预期一致的条带。同时,CIPK18在低温胁迫后葡萄叶片中蛋白表达水平与室温下相一致,但两种状态下均存在可能的磷酸化与泛素化修饰现象。本研究结果为进一步探究VaCIPK18的蛋白定位、表达及其功能奠定了基础。 相似文献
108.
为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMARTTM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。 相似文献
109.
为了解牛星状病毒(bovine astrovirus, BoAstV)ORF2基因的遗传进化并获得原核表达的衣壳蛋白,从牛腹泻粪便中提取总RNA,扩增BoAstV ORF2基因,将ORF2基因克隆至pMD19-T载体中并测序,利用生物信息学软件分析基因的遗传进化。将位于BoAstV衣壳蛋白高度保守区的ORF2-1200基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-ORF2-1200。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达并优化诱导条件,经过超声破碎离心并鉴定蛋白可溶性,最后利用亲和层析镍柱对重组蛋白进行纯化和Western blot鉴定。结果表明:ORF2基因全长2 304 bp,编码768 aa, ORF2基因属MAstV-28基因型,与日本毒株Ishikawa24-6亲缘关系最近,与20个参考毒株的ORF2基因氨基酸同源性为53.2%~86.0%。试验成功构建了重组载体,经条件优化,在37℃,1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小55 kDa左右,目的蛋白以包... 相似文献
110.
根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定。目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致。克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白。 相似文献