绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立     

曲可  刘欣钊  马惠海  曲磊  王成宇  马俊  吕礼良  朱日宁  张芳毓  王永志 《中国兽医杂志》2023,(7):62-69

为了建立检测绵羊家畜衣原体血清抗体的间接ELISA方法,本试验构建pET-28b-ompA重组表达质粒,经诱导表达和纯化后,对重组主要外膜蛋白(MOMP)进行Western blot鉴定;以MOMP为包被抗原,通过反应条件筛选建立绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、重复性和符合性,并进行临床样品检测。结果显示,MOMP以包涵体形式表达,经Western blot鉴定重组蛋白具有良好的反应原性。优化反应条件为：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃静置孵育1 h;血清抗体稀释倍数为1∶100,37℃反应1 h;酶标二抗稀释倍数为1∶5 000,37℃孵育1 h;底物显色条件为37℃避光5 min。利用52份绵羊血清确定ELISA方法的阳性判定临界值为P/N=2.156。该方法的敏感性、特异性和重复性较高。用该方法与间接血凝试验对86份血清进行检测,两者符合率为73.2%。用该方法对临床采集的205份绵羊血清样品进行检测,阳性率为34.1%。结果表明,本试验建立的绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可应用于临床检测。  相似文献   

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达     

林毅  林奇英  谢联辉 《分子植物育种》2003,(6)

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.  相似文献   

鸭源鸡杆菌pfs基因的扩增及原核表达     

姬向波  皇甫和平  张晓曼  唐桂芬  向瑞平 《郑州牧业工程高等专科学校学报》2021,(3):1-4

以鸭源鸡杆菌临床分离株G7的基因组为模板,采用PCR技术,扩增得到5′-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶基因(pfs)的全序列,对其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了同源性分析,构建了该基因的原核表达载体并诱导表达.G7的pfs基因全长693 bp,与其他3个参考鸭源鸡杆菌核苷酸序列的同源性均在93％以上.诱导表达...  相似文献   

豆类活性肽PA1b在大肠杆菌中的多拷贝串联表达     

黄欣媛  邹礼平  范红波 《江苏农业科学》2022,(15):57-62

为构建能表达串联豆类活性肽PA1b(pea albumin 1 subunit b)基因的重组大肠杆菌,并进行诱导表达和产物纯化。通过合成PA1b基因,采用同尾酶技术构建1～4拷贝数的串联PA1b基因,分别克隆至pET32a(+)原核表达载体上,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,亲和层析纯化融合蛋白,肠激酶切除融合标签和切开串联体,获得单体PA1b肽。结果显示,大肠杆菌转化子中的重组质粒pET32a(+)-nPA1b(n=1～4)经PCR及测序验证正确,经1 mmol/L IPTG 25℃诱导8 h,均能以包涵体形式表达出重组融合蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,串联拷贝数越多,融合蛋白中PA1b含量越高。Ni-NTA亲和纯化得到高纯度的4拷贝串联PA1b融合蛋白,经肠激酶充分酶切、超滤浓缩后获得重组PA1b多肽。获得了表达1～4拷贝串联PA1b基因的重组大肠杆菌,并通过酶解4拷贝PA1b融合蛋白制备了重组PA1b,为多拷贝法制备PA1b肽奠定基础。  相似文献   

新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达     

张婉琪  赵玉宾  丁繁萍  王青青  王哲红  胡建军 《塔里木大学学报》2021,(3):16-21

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体.测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1.重...  相似文献   

苦荞查尔酮合成酶多克隆抗体制备及组织表达分析     

李蒙  陈鹏 《西北农业学报》2022,(11):1491-1498

苦荞查尔酮合成酶(FtCHS)是黄酮类化合物合成过程中的限速酶之一,在苦荞黄酮类次生代谢物合成中起到重要作用。以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得FtCHS基因,通过生物信息学分析确定FtCHS的截短抗原基因序列(TrCHS)。再通过原核表达、亲和层析等方法制备并纯化TrCHS抗原,以纯化的抗原免疫大白兔获得TrCHS的多克隆抗体,利用半定量RT-PCR、Western blotting方法分析苦荞不同器官FtCHS的表达情况。结果表明,成功克隆FtCHS基因开放阅读框(ORF)大小为1 182 bp,共编码393个氨基酸,通过原核表达获得TrCHS抗原的分子质量约34.71 ku,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性,FtCHS基因在苦荞叶子、种子的表达量明显最高。  相似文献   

魔芋花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备     

唐国亮  张玉宝  王若愚  王亚军  赵霞  苏学思  金卫杰 《浙江农业学报》2022,34(11):2471-2481

采用小RNA测序技术对甘肃省榆中县疑似感染病毒病的当归[(Angelica sinensis(Oliv.)Diels]样品进行测序鉴定,发现样品中含有魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV),通过反转录PCR(RT-PCR)扩增KoMV衣壳蛋白(capsid protein, CP)的cp基因,克隆的KoMV cp基因连接原核表达载体pET-28a(+),导入E.coli Rosetta^TM(DE3)诱导表达蛋白,在Ni-NTA重力柱层析作用下纯化CP融合蛋白,并以此作为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。序列分析表明：KoMV cp基因片段大小为840 bp,编码280个氨基酸的外壳蛋白;与GenBank已注册同源性较高的KoMV分离物相比,核苷酸序列相似性为85.58%～99.41%,氨基酸序列相似性为89.32%～99.29%;KoMV的病毒种群分布存在明显的区域性和寄主差异。SDS-PAGE显示,不同温度诱导下KoMV CP融合蛋白在E.coli Rosetta^TM(DE3)中均以包涵体的形式大量表达,融合蛋...  相似文献   

两种激活处理促进小鼠孤雌胚胎原核形成     

严兴荣  陈冬梅  华进联  雷安民  杨艳红  都慧聪  窦忠英 《广西农业生物科学》2010,(6):1102-1107

不同人工处理方法激活哺乳动物卵母细胞的机理相似,但其激活效率存在差异。本研究以昆明（KM）、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1雌鼠来源的卵母细胞为对象,利用氯化锶（SrCl2,Sr2＋）联合细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）（Sr2＋＋CB）和离子霉素（ionomycin,Ion）联合6-二甲胺基嘌呤（6-dimethylaminopurine,6-DMAP）（Ion＋6-DMAP）两种激活方法处理下对比分析不同品系小鼠卵母细胞的激活效率,并以卵母细胞原核形成率、原核数量和孤雌胚胎体外发育来评价两种激活剂的激活效率。研究结果表明,Ion＋6-DMAP激活卵的1原核比率显著高于2原核（p〈0.05）,Sr2＋＋CB激活卵的2原核比率显著高于1原核（p〈0.05）;KM、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1各组孤雌胚胎卵裂率和激活率没有显著差异（P〉0.05）,但129/Sv×KM F1和C3H×KM F1囊胚发育率显著高于KM组（p〈0.05）。3种小鼠品系的卵母细胞用Sr2＋＋CB处理的孤雌胚胎发育率显著高于Ion＋6-DMAP。结果证明,Sr2＋＋CB处理小鼠卵母细胞的激活效率明显优于Ion＋6-DMAP;129/Sv×KM F1和C3H×KM F1的孤雌胚胎体外发育率显著高于KM小鼠,为研究小鼠遗传背景影响孤雌胚胎发育的机理提供参考。  相似文献   

茶树黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的克隆及功能分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

胡晓婧  许玉娇  高丽萍  夏涛  王云生 《农业生物技术学报》2014,(3):309-316

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是类黄酮代谢途径中的关键酶。本研究采用逆转录PCR技术,获取了茶树(Camellia sinensis)F3H的开放阅读框(open reading frame,ORF)包含1 107个碱基,编码含有368个氨基酸的蛋白质,推测分子量为41.46 kD,等电点为5.61;实时荧光定量PCR表明,CsF3H在叶片中表达量较高,且受光照影响;将此基因重组到表达载体PRSF上,导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行原核表达,优化原核表达的条件,结果表明,最佳诱导温度28℃、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1.0 mmol/L、诱导时间5 h;利用高效液相色谱法(HPLC)对重组蛋白进行了体外酶活的检测,结果表明,重组目的蛋白具有F3H酶活性,可将反应底物柚皮素(N)和圣草酚(E)分别转化为二氢山奈素(DHK)和二氢槲皮素(DHQ);当E作为底物时,酶活性明显高于柚皮素。本研究结果为茶树F3H酶动力学研究和其器官组织特异性研究提供了基础资料。  相似文献   

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备     

巩培杰  张朝红  魏蓉  李树秀  王跃进 《农业生物技术学报》2013,21(6)

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.  相似文献