Establishment and Application of Multiplex PCR Detection Method for Three Main Gram-negative Bacilli from Livestock and Poultry     

MA Guang-qiang  LIU Li-juan  LONG Dan-dan  YUE Jun  LI Yi  WEN Ming  CHENG Zhen-tao  ZHOU Bi-jun 《中国畜牧兽医》2016,43(3):577-584

To establish a rapid and accurate multiplex PCR method for the clinical detection of three main Gram-negative bacilli from livestock and poultry in Guizhou province,three pairs of specific primers were designed and synthetized according to 23S rRNA gene of Escherichia coli(E.coli),KMT gene of Pasteurella and invA gene of Salmonella.In this study,A mutiplex PCR reaction system was established for detecting the three pathogens at the same time,and the reaction system was optimized and it's performance was evaluated.The results showed that the best concentration of primers was 1.0,1.5and 1.0 μmol/L,respectively,and the best annealing temperature was 56 ℃.The results of performance evaluation showed that the method had good specificity and sensitivity,the sensitivity of Salmonella could reach to 1.44 pg/μL,was the highest.70 Gram-negative clinical isolated strains were detected by the multiplex PCR and it was proofed that the method could identify the three pathogens rapidly and accurately,and it could provide effective technical for the rapid clinical diagnosis and epidemiological survey.  相似文献   

多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成及其调控机制研究进展     

关丽君  薛云  丁文文  赵战勤 《中国农业科学》2020,53(3):658-668

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。多杀性巴氏杆菌的细胞表面具有一层黏液样的荚膜多糖,是其重要的结构成分和毒力因子,在细菌与宿主的相互作用中起到重要作用,促进细菌粘附于宿主表面,增强细菌的毒力。多杀性巴氏杆菌荚膜的分子结构与脊椎动物的糖胺聚糖（GAG）相似,都由重复的二糖单元聚合形成线性多糖链,这是该菌在感染宿主过程中进行分子伪装、抵抗吞噬和发生免疫逃逸的重要免疫学物质基础。近年来,在多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成及其调控机制方面取得了一系列重要的研究进展,为多杀性巴氏杆菌荚膜的分子致病机理研究提供了一定的基础知识,为多杀性巴氏杆菌荚膜多糖疫苗的研发提供了理论依据。文章系统阐述了多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成途径及其表达调控机制,主要包括荚膜的血清分型、荚膜多糖的成分与结构、荚膜的生物合成基因簇与功能、荚膜多糖的分子合成机制、荚膜生物合成基因簇的表达调控机制,共5个方面。依据荚膜抗原,多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F共5种荚膜血清型。A型荚膜GAG成分是透明质酸、D型是肝素、F型是软骨素,分别由其相应的二糖单元[β-葡糖醛酸/β-乙酰葡糖胺]、[β-葡糖醛酸/α-乙酰葡糖胺]、[β-葡糖醛酸/β-乙酰半乳糖胺]重复构成;B型荚膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖以某种结构形式聚合而成,E型荚膜多糖的成分与化学结构尚不确定。多杀性巴氏杆菌A型、B型、D型、E型和F型荚膜多糖生物合成的相关基因以基因簇的形式存在,分为3个不同的功能区,R1、R2和R3;R1区负责转运荚膜多糖,R2区负责单糖的活化和荚膜多糖的组装,R3区负责荚膜多糖的修饰（磷脂替换）;根据R2区结构和基因数量的不同又可将5种荚膜的生物合成基因簇分为两类：A型、D型、F型为I类,R2区含有4个基因;B型和E型为II类,R2区含有9个基因,且利用R2区特异性基因设计引物,可以通过PCR方法快速鉴定多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型。多杀性巴氏杆菌的荚膜GAG在细胞质中生成,由R1区编码蛋白所形成的ABC转运体输出至细胞表面,末端糖脂通过分子间氢键与细胞壁紧密结合,形成菌体表面的粘液状荚膜;在多杀性巴氏杆菌荚膜GAG的生物合成过程中,位于R2区的糖基转移酶基因决定了活化单糖的种类和组装后荚膜多糖的类型。在多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成基因簇中,R1和R2区形成一个操纵子,转录方向一致,而R3转录方向与其相反,两者的启动子区域均位于R2和R3区域之间的DNA序列上;多杀性巴氏杆菌荚膜生物合成基因簇的转录过程受Fis蛋白正向调控,翻译过程主要受Hfq蛋白正向调节。  相似文献   

Acute phase protein changes in calves during an outbreak of respiratory disease caused by bovine respiratory syncytial virus     

Toomas Orro  Tarja PohjanvirtaUlla Rikula  Anita HuovilainenSakari Alasuutari  Liisa SihvonenSinikka Pelkonen  Timo Soveri 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》2011,34(1):23-29

Bovine acute phase proteins (APPs), lipopolysaccharide binding protein (LBP), serum amyloid A (SAA), haptoglobin (Hp) and alpha₁-acid glycoprotein (AGP) were evaluated as inflammatory markers during an outbreak of bovine respiratory disease (BRD) caused by bovine respiratory syncytial virus (BRSV). Calves (n = 10) presented mild to moderate signs of respiratory disease. Secondary bacterial infections, Pasteurella multocida and Mycoplasma dispar as major species, were detected in tracheobronchial lavage samples. Concentrations of SAA and LBP increased at week 1 had the highest values at week 3 and decreased at week 4 of outbreak. Some calves had high Hp concentrations at week 3, but AGP concentrations did not rise during respiratory disease. Higher SAA, LBP and Hp concentrations at a later stage of BRD (week 3) were associated with the low BRSV-specific IgG₁ production, suggesting that these calves had enhanced inflammatory response to the secondary bacterial infection. In conclusion, APPs (especially SAA and LBP) are sensitive markers of respiratory infection, and they may be useful to explore host response to the respiratory infections in clinical research.  相似文献   

禽多杀性巴氏杆菌血清型与外膜蛋白型相关性研究     

高明燕  徐步  龚建森  范建华  吕晓娟  刘学贤  胡茂志 《黑龙江畜牧兽医》2011,(15)

为了解禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)分离菌株的荚膜血清型、菌体血清型与外膜蛋白型之间的相关性,首先对自行分离的10个菌株采用间接血凝试验和琼脂扩散试验进行鉴定(均为A:1);然后采用超声波破碎、高速离心和十二烷基肌氨酸钠提取外膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳的方法对上述10个菌株与C48-1(A:1)、X73(A:1)、P1059(A:3)、CU(A:3,4)等一起进行外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMP)分型研究。结果表明:14个禽多杀性巴氏杆菌菌株以2个主要蛋白OmpH和OmpA的差异为依据分为3种主要OMP型;依据次要蛋白的差异,OMP-1,3菌株进一步分为OMP型1.1,1.2和3.1,3.2,其中OMP型1.1有6个菌株,OMP型1.2有5个菌株;OMP型2有1株(YZ7031);P1059为OMP型3.1;CU为OMP型3.2;另外,血清型为A:1的12个菌株中有11个菌株外膜蛋白型均为OMP-1型,血清型为A:3、A:3,4的菌株外膜蛋白型属于3型。说明禽多杀性巴氏杆菌血清型与特定的外膜蛋白型具有很强的相关性。  相似文献   

禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗在小鼠体内免疫效果试验     

牛明福  宫强  秦翠丽  孙晓菲  王帅涛  程铭 《中国兽医学报》2011,31(6)

应用PCR技术扩增获得禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体,再亚克隆到真核表达质粒载体pCDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcA,体外转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验检测其转录表达情况。动物免疫分为3组:pCDNA3.1(+)组、PBS对照组和pcA组,每组16只BALB/c小鼠,pCDNA3.1(+)组和pcA组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μL 1×PBS,各组均免疫3次,每次间隔2周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免2周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况。强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率。结果显示,间接免疫荧光试验和RT-PCR检测结果均表明pcA可在体外培养的Vero细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,pcA组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极为显著(P<0.01)。经提取的禽多杀性巴氏杆菌总外膜蛋白(Omps)刺激后,pcA组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P<0.05)。脾细胞产生的IFN-...  相似文献   

多杀性巴氏杆菌强毒株对雏鸭的致病性研究     

宋晓娜  刁有祥  张颖 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2013,41(2):13-18

【目的】探讨鸭源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)强毒株对雏鸭的致病性。【方法】以口服灭菌生理盐水的雏鸭为对照,通过口服和滴鼻接种途径将PM人工感染雏鸭,观察雏鸭的发病情况;于接种后不同时间内随机剖杀试验组和对照组雏鸭,采集肝脏、肺、心脏和脾脏、胸腺、腺胃和小肠等组织,常规方法制备石蜡切片,进行H.E.染色,观察各器官组织学变化;利用建立的间接免疫荧光法对PM在雏鸭体内的分布进行研究。【结果】接种PM后,引起雏鸭出现精神不振,呼吸困难,腹泻等症状;剖检病变以心包积液、肺出血和肝脏点状坏死为特征。PM动态增殖检测结果表明:滴鼻接种后12h,肺中PM含量最高,达到4.47×103 CFU/g,而口服接种后12h,胸腺中PM含量最高,达到5.12×103 CFU/g;2种途径接种PM后18～30h均以雏鸭胸腺PM含量最高。病理组织学变化以肺脏充血、出血,肝脏脂肪变性,脾索紊乱等为特征;荧光阳性信号主要分布于肺、肝脏、胸腺和脾脏等器官。【结论】PM感染主要引起雏鸭的出血、败血性变化;滴鼻接种PM对鸭的致病力明显高于口服接种;胸腺、肺、肝脏和脾脏是PM侵害的主要靶器官。  相似文献   

多杀性巴氏杆菌外膜蛋白免疫作用研究进展     

白彤  屈红安  穆秦  岳登  付塞琴  崔娟  田亮 《中兽医医药杂志》2013,(6):30-33

外膜蛋白是细胞膜中的一种重要成分之一,在免疫方面的作用越来越受到关注.随着对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白免疫原性及保护性的深入研究,开发有效的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗将成为可能.笔者等就具有免疫作用的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白的研究进展情况进行综述.  相似文献   

鸭疫里氏杆菌(2型)灭活疫苗的研制   总被引：2，自引：0，他引：2  

邓舜洲  何后军  温庆琪  戴朝洲  张文波 《江西农业大学学报》2002,24(5):569-573

以 2型鸭疫里氏杆菌江西分离株为菌种 ,制备了含不同菌数的 2型铝胶疫苗 ,分别经颈背部皮下接种 5日龄雏鸭 (0 .5mL/羽 ) ,免疫后 5 ,1 0 ,1 5d分别用同源菌株攻击 ,保护指数为 60左右 ;于 2 5日龄第 2次免疫 ,二免后第 5d的保护指数达 91 .7～ 1 0 0。本试验还对鸭疫里氏杆菌的培养条件、灭活条件进行了优化。  相似文献   

不同培养工艺制备的禽多杀性巴氏杆菌菌苗抗原的免疫原性比较试验   总被引：1，自引：0，他引：1  

沈志强  刘吉山  李峰  徐可利  赵蕾  吴信明  林初文 《中国兽药杂志》2004,38(6):4-6

为比较不同培养工艺制备的禽多杀性巴氏杆菌抗原的免疫原性,对禽多杀性巴氏杆菌标准强毒株C48-1株采用固体表面培养法和液体高密度发酵法制备疫苗并进行了免疫对比试验.结果表明,固体表面培养法制备的抗原菌体形态结构较均一,抗原成分稳定一致,并且含有较丰富的荚膜;而液体高密度发酵法制备的抗原形态结构大小不一,抗原成分不够稳定一致,含荚膜也较少.将两种方法制备的抗原按相同工艺制备成禽霍乱蜂胶灭活疫苗,效力检验结果显示二者差异极显著,固体表面培养法制备的疫苗免疫后14 d和90 d时保护率均为80%～100%,平均93%;液体高密度发酵法制备的疫苗免疫后14 d和90 d时保护率分别为40%～60%、60%～80%,平均为53%和67%.  相似文献   

脂质体-禽巴氏杆菌荚膜抗原的免疫研究     

王兴龙  刘玉斌  冯来坤  王玉炯  刘轩  谭建华 《中国兽医学报》1993,(2)

将禽巴氏杆菌荚膜粗提物经SephadexG—200分子筛凝胶过滤层析,获得纯化荚膜抗原;然后用反相蒸发法制备脂质体-荚膜抗原(A组),并以单纯荚膜抗原(B组)、禽霍乱“731”菌苗(C组)作对照,进行免疫试验,以酶标单克隆抗体间接ELISA,分别检测IgM和IgG的效价.结果,免疫后3个组的IgM效价相差都不显著(P>0.05),A组的IgG效价明显增高,与其他两组差异非常显著(P<0.01).3个组的IgM、IgG消长规律一致,IgM于免疫后7d开始上升,峰值在14d,其后下降迅速,第8周后降至免疫前水平,IgG于免疫后14d开始明显上升,峰值在28d,其后缓慢下降.保护率,A、B、C组分别为67％、33％、33％.结果表明,脂质体对禽巴氏杆菌荚膜抗原具有明显的佐剂作用.  相似文献