辣椒BES1基因家族鉴定及表达分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

孟纯阳  魏小春  赵艳艳  原玉香  王志勇  杨双娟  姜俊  张晓伟 《核农学报》2019,33(8):1467-1473

BES1基因是油菜素内酯信号途径中的关键转录因子。为了解辣椒中BES1基因家族功能,以已测序辣椒CM334为试验材料,根据已公布辣椒基因组数据,本研究利用生物信息学方法对辣椒BES1基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和生物非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,辣椒中有9个候选BES1基因,根据BES1基因结构可将其分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大类,Class Ⅰ 和 Class Ⅱ 在结构上差异较大。辣椒BES1编码蛋白介于181~713个氨基酸范围内,分子量为20.22~78.23 kDa,等电点介于5.48~9.23。转录组数据分析发现,辣椒BES1基因在辣椒中表达具有差异性。在脱落酸、低温、高温、茉莉酸甲酯和疫病胁迫下CA04g20150和CA12g17430均被诱导上调,表明其在生物和非生物胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探究BES1基因家族调控植物抗逆的分子机制奠定了基础。  相似文献   

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析          下载免费PDF全文

陈蒙  刘海峰 《西南大学学报(自然科学版)》2019,41(10):11-21

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.  相似文献   

山药PAL基因全长cDNA序列的克隆、表达与分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

周生茂  王玲平  向珣  韦本辉  李杨瑞  方锋学  韦威旭  曹家树 《核农学报》2008,22(6):781-788,859

为了阐明苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC4.3.1.5)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的分子机理,本研究运用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技术从大薯(Dioscorea alataL.)’Zixiao’地下块茎中克隆到同一个PAL基因的3个片段,即长度分别为1 145bp、1 151bp和424bp的中间片段、3’端和5’端的cDNA序列;将3段cDNA序列拼接后获得大小为2 376bp的PAL基因全长cDNA序列,该序列含有一个1986bp的最大开放阅读框(ORF),一个28bp的5’端非翻译区,一个362bp含25 nt的Poly(A+)尾的3’端非翻译区,最大ORF可推测编码一个包括PAL酶活性中心的特征序列(GTITASGDLVPLSYIA)在内的661个氨基酸的多肽,分子量为71.974kDa,等电点6.310;大薯地下块茎的PAL基因分别在核苷酸与氨基酸水平上和GenBank中所选已知其他物种的同源性为73%~77%和76%~82%,说明PAL基因在系统进化上相对保守;RT-PCR分析表明该基因仅在地下块茎中表达,而且表达丰度在收获前逐渐降低。  相似文献   

绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在 HEK 293T细胞中的表达     

吴凌娟  仲飞  解民  靳慧君  王微  韩冬梅 《农业生物技术学报》2008,16(6)

采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。  相似文献   

一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性     

谭婉新  刘利  胡亚林  段承杰  唐纪良  冯家勋 《广西农业生物科学》2008,27(1):7-13

从水牛瘤胃内容物的添加滤纸为碳源的富集培养物中提取未培养微生物的总DNA,以柯斯质粒为载体构建了1个含约8000个克隆的宏基因组文库,对文库进行活性筛选获得1个既表达CMCase活性又表达4-MUCase酶活性的克隆。亚克隆及测序分析发现1个潜在的可编码333个氨基酸的ORF(Open Reading Frame),其蛋白质产物与1个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶Cel A的同源性最高,两者的一致性为53%,相似性为68%。将PCR扩增的该基因完整的ORF克隆入表达载体pET30a(+),在大肠杆菌中得到其过量表达产物。经过Ni-NTA纯化后,该表达产物(Umcel5K)具有CMCase活性和4-MUCase酶活性,其最适pH是4.5~5.0,最适温度是50°C。pH耐受性检测表明,该酶在pH4~4.5比较稳定。温度耐受性实验表明该酶不耐高温,在55°C以下比较稳定。经过镍柱纯化的酶液比活为26.15 U/mg。部分金属离子如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活,而另外一些金属离子如K+、Li+等对Umcel5K的活性影响不大。  相似文献   

大豆LIM转录因子家族鉴定及盐胁迫响应分析     

陈奕博  杨万明  岳爱琴  王利祥  杜维俊  王敏 《中国农业大学学报》2023,28(4):26-40

为探究大豆LIM转录因子家族基因在应答盐胁迫中的功能,利用生物信息学方法,根据大豆全基因组数据,共鉴定出21个LIM基因,命名为GmLIM01～GmLIM21,分析大豆LIM基因家族的染色体位置、蛋白质的理化性质、进化关系、保守基序以及对非生物逆境胁迫的响应。结果表明,这些GmLIM基因在大豆20条染色体中的14条染色体上分布不均,片段重复是大豆LIM家族扩大的主要原因。根据系统发育进化分析,大豆21个LIM基因可分为5个亚家族,与其他9个物种的LIM基因一起构建进化树,也可分为5个亚家族。大豆的21个GmLIM基因共包含10个基序,大部分LIM蛋白含有motif 1、motif 2和motif 4这3个保守基序。此外,顺式调控元件的分析表明,在GmLIM基因的启动子序列中,与光响应、生长发育、植物激素和非生物逆境胁迫应答相关的调控元件非常丰富。定量PCR结果表明,在盐胁迫处理后大豆叶和根中GmLIM07、GmLIM17基因的表达量分别在3和6 h达到峰值,后随着处理时间的加长表达量下降。综上GmLIM基因在大豆的盐胁迫应答过程中具有重要的调控作用。  相似文献   

藏绵羊不同部位骨骼肌营养成分、肌纤维特性及与相关基因表达的关联分析     

赵丽  沈继源  包高良  赵鹏飞  石斌刚  刘秀  李少斌  罗玉柱 《西北农业学报》2023,(6):825-834

旨在比较藏绵羊母羊7个部位肌肉（臂三头肌、冈上肌、股四头肌、背最长肌、腰大肌、胸斜方肌和小腿肌）的营养成分、肌纤维特性及其与产肉性能相关基因（ AKT1、 mTOR和 FABP3）表达水平的相关性。结果表明,藏绵羊不同部位肌肉含水量均在75%左右;小腿肌的蛋白含量最高,其次是背最长肌（P>0.05）,腰大肌的蛋白含量低于小腿肌（P<0.01）;背最长肌肌内脂肪（IMF）含量高于除腰大肌外的其他部位（P<0.05）,而小腿肌IMF含量最低（1.15%）。肌纤维横截面积大小为冈上肌>股四头肌>臂三头肌>小腿肌>胸斜方肌>腰大肌>背最长肌;肌纤维直径是股四头肌>冈上肌>小腿肌>臂三头肌>腰大肌>胸斜方肌>背最长肌;背最长肌密度最大,高于冈上肌（P<0.05）;肌纤维面积、直径与肌内脂肪含量均呈负相关,而肌纤维密度与IMF含量呈正相关;肌纤维面积与肌纤维直径呈极显著正相关（r=0.842）,而肌纤维面积和肌纤维直径与肌纤维密度呈极显著负相关（r=-0.906、-0.831）。 AKT1基因在小腿肌中的相对表达量高于其他部位（P<0.05）,而 mTOR基因在股四头肌中的相对表达量高于小腿肌、背最长肌（P>0.05）,显著高于臂三头肌、冈上肌及腰大肌（P<0.05）,与胸斜方肌差异极显著（P<0.01）; FABP3基因在小腿肌中的相对表达量低于除冈上肌外的其他部位（P<0.05）。 AKT1和 mTOR基因表达量与肌肉蛋白含量均呈正相关,其中 AKT1基因与蛋白含量呈极显著正相关（r=0.601）; FABP3基因表达量与IMF含量呈极显著正相关（r=0.728）。综合分析可知,藏绵羊小腿肌更符合人们对高蛋白、低脂肪羊肉特点的要求,而背最长肌相比于其他部位嫩度更好; AKT1和 mTOR基因表达量与藏绵羊不同部位肌肉蛋白质合成呈正相关, FABP3基因表达量与藏绵羊不同部位肌肉IMF沉积呈正相关。  相似文献   

慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证     

李晓娇  朱新宇  邹娴  严霞  何燕华  罗成龙 《广东农业科学》2023,50(2):125-135

【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）,并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。  相似文献   

小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析     

董飞燕  宋婧含  张华东  吴昊天  李雅倩  刘孟伟  高春保  方正武  刘易科 《浙江农业学报》2023,35(1):23-32

GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE, repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因,从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1),克隆该基因的全长序列,并对其进行生物信息学和表达模式分析,以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明：TaPAT1-2D序列全长1 668 bp,编码555个氨基酸,分子量约为61.34 ku; TaPAT1-2D蛋白含有典型GRAS功能结构域,在进化关系上与水稻OsCIGR2(LOC＿Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量PCR结果显示,接种禾谷镰刀菌孢子液72 h后,TaPAT1-2D基因在4个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调,表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬...  相似文献   

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化     

刘郁夫  郝文茜  冯美莹  欧阳征亮  陈瑞爱 《广东农业科学》2023,50(10):149-156

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。  相似文献