伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究     

常雯茹  段利芳  杨乐  马英先  王棋  翟云云  周鲁豫  张爽  明胜利  杨国宇  王江  褚贝贝 《中国畜牧兽医》2021,(1)

试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。  相似文献   

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究     

常雯茹  段利芳  杨乐  马英先  王棋  翟云云  周鲁豫  张爽  明胜利  杨国宇  王江  褚贝贝 《中国畜牧兽医》2021,48(1):83-92

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。  相似文献   

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立     

李雪峰  康斌  赵炳武  武玉梅  戴伶俐  董鹏  张建春  张春阳  斯琴高娃 《畜牧与饲料科学》2021,42(1):8-13

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。  相似文献   

2020年新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测与分析     

王紫阳  屈勇刚  孙琼飞  党瑞莹  周海琴  张小玉  张家瑞  常军帅  李岩 《中国猪业》2021,16(3):58-61

为了解2020年新疆地区猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）抗体水平及其消长规律,本试验采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法对1 218份血清中PRRSV免疫抗体水平进行检测和分析。结果显示,PRRSV抗体平均阳性率为78.49%（956/1218）,高于国家规定标准（70%）。S/P的平均值为1.22±0.84,变异系数为69.45%。不同类别猪群抗体平均阳性率在59.19%~91.50%之间,有一定的差异。在调查的10个规模化养殖场中,9个场PRRSV免疫抗体阳性率达到国家标准。不同类别猪群PRRSV变异系数较高,需进一步对现有的免疫程序进行调整和完善,确保各猪群健康。  相似文献   

2019—2020年新疆部分地区猪PCV2的抗体水平检测及分析          下载免费PDF全文

王紫阳  谢静  欧亚妮  邱国斌  屈勇刚  党瑞莹  高嘉豪 《中国猪业》2021,16(6):67-70

为了解2019—2020年新疆地区猪圆环病毒病2型（PCV2）抗体水平及其消长规律,本试验采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对475份血清中PCV2免疫抗体水平进行检测和分析。结果显示,PCV2抗体平均阳性率为69.68%（331/475）,未达到国家规定标准（70%）。S/P的平均值为1.56。不同类别猪群抗体平均阳性率在42.50%~86.67%之间,有一定的差异。在调查的5个规模化养殖场中,仅有2个场PCV2免疫抗体阳性率达到国家标准。各场应根据抗体检测结果,进一步对现有的免疫程序进行调整和完整,确保各猪群健康。  相似文献   

羊传染性脓疮皮炎治疗     

舍卫俊  哈德力别克·吾特开 《畜牧兽医科学(电子版)》2021,(5):95-96

羊传染性脓痂皮炎又被称为羊传染性脓疱病、羊口疮病,是由羊传染性脓疱病毒感染引发的一种急性接触性传染性疾病。羊养殖主产区均有发生,是一种常见疾病。羊传染性脓痂皮炎虽然造成的死亡率较低,但是会严重影响羊群正常采食,造成营养物质供给不足,身体逐渐消瘦,抵抗能力变差,易继发感染多种传染性疾病,表现出复杂的临床症状,威胁羊群健康。  相似文献   

猪丹毒和猪肺疫混合感染综合诊治     

张成叶  白润虎  白军平 《畜牧兽医科学(电子版)》2021,(5):57-58

疫病一直是生猪养殖中影响猪群健康的重要因素,受到疾病影响的猪群会给养殖户带来巨大的经济损失,严重阻碍养殖业的发展。该文将简要概述猪丹毒和猪肺疫的病理状况,分析猪丹毒和猪肺疫混合感染的发病特征和临床症状,并研究综合诊治猪丹毒和猪肺疫混合感染的方法,降低猪丹毒和猪肺疫混合感染对生猪养殖的影响。  相似文献   

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV     

LONG Fei-xiang  SHI Kai-chuang  ZHANG Zhen  YIN Yan-wen  CHEN Han-zhong  MO Sheng-lan 《中国畜牧兽医》2016,43(10):2518-2526

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.  相似文献   

Analysis on Differential Expression Genes in Porcine Aortic Vascular Endothelial Cells Induced by Apolipoprotein C Ⅲ     

YUE Yuan  CHEN Hong-yan  WANG Jia-wei  XU Ming-qiang  DING Yu  JIANG Hao  GAO Yan  ZHANG Jia-bao  YAN Shou-qing 《中国畜牧兽医》2016,43(3):585-591

The aim of this study was to investigate the differential expression genes induced by ApoCⅢ,and study the function of ApoCⅢ.Porcine aortic vascular endothelial cells were successfully isolated using enzyme digestion,and then screened the differential expression genes induced by ApoCⅢ using the Solexa high-throughput sequencing technology.The results showed 647 differential expression genes,including 390 up-regulated genes and 257 down-regulated genes.The qRT-PCR results verified that the gene expression results from Solexa sequencing data were reliable.GO and Pathway analysis showed that the function of differential expression genes were related to immune response,cell apoptosis and death.These findings suggested that ApoCⅢ affected the physiological function of porcine aortic endothelial cells by the molecular pathways of inflammation,cell adhesion and apoptosis,which provided a theoretical basis for further understanding the molecular mechanisms of atherosclerosis caused by ApoCⅢ.  相似文献   

Prokaryotic Expression and Antigenicity Analysis of Porcine Japenese Encephalitis Virus Envelope Protein Domain Ⅲ     

HOU Hua-yan  DING Ling-ling  LV Mao-jie  YANG Bao-shou 《中国畜牧兽医》2016,43(4):934-939

In order to analyze the antigenicity of porcine Japanese encephalitis virus (JEV) E protein domain Ⅲ, which was expressed by pET-28a vector with His-tag and purified through Ni-NTA, the BALB/c mice were immunized with the purified protein.We identified the antigenicity of domain Ⅲ of E protein and the anti-mice and anti-porcine JEV E Ⅲ protein specific antibody titers by SDS-PAGE, Western blotting, indirect ELISA and IFA.SDS-PAGE results showed the expressed target protein existed mainly in the form of inclusion body.Western blotting, ELISA test results showed that the protein had good reactivity with anti-serum.The mice immunized with the purified JEV E Ⅲ protein generated 1×10⁵ anti-JEV E Ⅲ protein specific antibody titers by ELISA, and the porcine immunized with the porcine JEV generated 5.1×10⁴ anti-JEV specific antibody titers.The IFA results showed that JEV E Ⅲ protein anti-serum could identify JEV antigen.The above results showed that the recombinant JEV E Ⅲ had good antigenicity.These results provided important basis for development of diagnostic antigen for JEV.  相似文献