猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用     

张记宇  韩郁茹  时洪艳  陈建飞  张鑫  刘建波  张燎原  冯书风  冯廷帅  季朝阳  石达  冯力 《畜牧兽医学报》2021,52(10):2887-2894

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10¹~3.31×10⁷拷贝·μL^-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R²）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10¹拷贝·μL^-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^6.7、10^5.3拷贝·mL^-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。  相似文献   

猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用     

麻园  石正旺  罗俊聪  杨波  王丽娟  万颖  宋锐  曹丽艳  周改静  田宏  郑海学  陈轶霞 《畜牧兽医学报》2021,52(6):1744-1752

旨在建立猪瘟病毒（CSFV）化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法。该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均无交叉反应;批内变异系数为1.80%~6.88%,批间变异系数为1.11%~9.18%,重复性好。通过对152份田间猪血清样品的检测并与商品化CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行比较,其Kappa值为0.929,具有高度的一致性。综上表明,本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好、简单快速,可应用于临床血清CSFV抗体的检测。  相似文献   

猪ADAR2基因全长cDNA克隆、序列特征及表达模式分析     

张跃博  王立刚  侯欣华  刘欣  颜华  张龙超  王立贤 《畜牧兽医学报》2021,52(3):620-629

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶2基因（ADAR2）全长cDNA序列,同时对该基因在猪不同组织中的表达规律进行探索。利用RACE （rapid-amplification of cDNA ends）对大白猪ADAR2基因mRNA全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR方法检测35日龄大白猪心、肝、肺、肾、脾、脑、小肠、背最长肌和背部脂肪9种组织中ADAR2的表达水平。结果表明,猪ADAR2基因cDNA全长6 305 bp,共包含12个外显子,编码704个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的CDS区核酸序列和氨基酸序列的一致性均在84%以上。该基因编码的蛋白含有2个双链RNA结合基序和一个脱氨酶结构域。猪ADAR2在检测的各组织中均表达,其中在肺中的表达量最高。综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR2基因全长cDNA序列,并且发现其在猪体内广泛表达,为深入研究ADAR2的功能奠定了良好的基础。  相似文献   

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价     

周景云  刘百红  刘雪微  杨欣艳  李宝春  陈西钊 《畜牧与兽医》2021,(2):82-87

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。  相似文献   

Selenium supplementation improves nutrient intake and digestibility,and mitigates CH4 emissions from sheep grazed on the mixed pasture of alfalfa and tall fescue     

Yueting Pan  Yongjia Wang  Shanning Lou  Metha Wanapat  Zhaofeng Wang  Wanhe Zhu  Fujiang Hou 《Journal of animal physiology and animal nutrition》2021,105(4):611-620

Low selenium (Se) in soil and forage can adversely affect on the quality of animal-derived foods, and hence on human health. Lambs grazed on mixed pastures of alfalfa (Medicago sativa) and tall fescue (Festuca arundinacea) were supplemented with five levels of Se [0, 3, 6, 9 and 12 µg/kg body weight (BW)]. The intake of dry matter (DM) and organic matter (OM) varied with the level of Se supplementation, with a peak at 6 µg Se per kg BW (p ≤ 0.05). Gross energy (GE) intake, digestive energy (DE) intake and metabolic energy (ME) intake were higher at 6 µg Se per kg BW than at other Se levels (p < 0.01); in addition, methane energy (CH₄-E) output was lower at 6 µg Se per kg BW. Supplementation with Se significantly increased nitrogen (N) intake, faecal N and urine N, for which the peak values were 20.2 g N/, 5.62 g N/day and 7.92 g N/day, respectively, at 6 µg Se per kg BW. Se intake, blood Se, faecal Se, urine Se and retained Se were negatively correlated with forage crude protein (CP) content (p < 0.001) but were positively correlated with the content of neutral detergent fibre (NDF) (p < 0.001) and acid detergent fibre (ADF) (p < 0.001). Thus, we recommend the addition of 6 µg Se per kg BW to sheep grazed on pastures in regions with low soil Se.  相似文献   

Adjusted method of penis fixation during boar semi-automatic semen collection aiming to reduce bacterial contamination     

Aline Fernanda Lopes Paschoal  Ana Paula Gonçalves Mellagi  Cristina Vicenti Ferrari  Karine Ludwig Takeuti  Gabriela da Silva Oliveira  Mari Lourdes Bernardi  Rafael da Rosa Ulguim  Fernando Pandolfo Bortolozzo 《Reproduction in domestic animals》2021,56(6):897-904

Semen collection has an essential role in the initial bacterial load in boar ejaculates and extended semen. The study aimed to explore the efficacy of an adjusted penis fixation in a semi-automatic collection system on reducing bacterial contamination of ejaculates in two-boar studs with different scenarios. Historically, stud A had low levels of bacterial load in raw semen, while stud B had a high level of contamination. A total of 56 mature boars had their semen collected using two methods of penis fixation: (a) Traditional: The penis was fixed directly with the artificial cervix and transferred to the adjustable clamp; (b) Adjusted: The fixation was performed with one gloved-hand, and after exteriorization, the penis was gripped using the artificial cervix with the other gloved-hand and transferred to the adjustable clamp. The bacterial load (p = .0045) and the occurrence of ejaculates >231 CFU/ml (p = .0101) were reduced in the Adjusted compared to the Traditional method. Bacterial load was reduced when using the Adjusted method in stud B (p = .0011), which showed a greater occurrence of critical factors for bacterial contamination (p ≤ .0034). The Adjusted method reduced the occurrence of ejaculates >231 CFU/ml when the preputial ostium was dirty (p = .016) and the duration of semen collection was >7 min (p = .022) compared to the Traditional method. In conclusion, the Adjusted penis fixation was efficient in reducing bacterial load of ejaculates, mainly in boar stud B, which had high contamination challenges.  相似文献   

液相色谱-串联质谱法测定猪尿液中地西泮及其7种代谢物残留     

张祖维  李木子  李雪莲  张鸿伟  曹旭敏  孙晓亮  隋金钰  宋翠平  霍乃蕊  赵思俊 《中国动物检疫》2021,38(3):112-118

为建立快速测定猪尿中地西泮及其7种代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)确证方法,本研究优化了样品净化的阳离子交换固相萃取柱(PCX柱)及其淋洗洗脱条件。猪尿液酸化后直接经PCX柱净化,依次用水、60%甲醇水溶液淋洗,最后用5%氨化甲醇洗脱;选用BEH C18色谱柱分离,UPLCMS/MS进行检测,以基质匹配标准曲线定量。结果显示:8种药物在0.3~20.0μg/L范围内具有良好的线性关系(R²≥0.995),检出限和定量限分别为0.1μg/L和0.3μg/L;各药物在3个添加浓度下回收率为73.6%~95.3%,日内、日间相对标准偏差分别为2.9%~18.6%(n=6)和2.2%~12.6%(n=3)。结果表明,本方法操作简单、快速,灵敏度高、特异性好。  相似文献   

猪戊型肝炎病毒ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢的lncRNA-mRNA调控网络的鉴定     

焦寒伟  周志雄  李梦娟  肖玉  李博文  郭晓奕  曾慧  顾国婧  帅学宏 《中国畜牧兽医》2021,48(12):4618-4627

为初步鉴定并挖掘出猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,本试验通过构建腺病毒过表达载体,制备高滴度过表达腺病毒,介导猪 HEV-ORF3在HepG2细胞中实现过表达。Western blotting检测ORF3蛋白过表达成功后,运用lncRNA高通量组学测序,筛选出差异表达的lncRNA并进行靶向差异基因预测,对lncRNA靶向差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,初步鉴定出与核黄素代谢信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络。Western blotting结果显示,在约为12 ku处出现目的条带,说明成功实现腺病毒介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中过表达。lncRNA高通量组学测序结果显示,共发现102个显著差异表达lncRNAs表达量上调,80个显著差异表达lncRNAs表达量下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,初步挖掘出lncRNA(MSTRG.13995.2)和lncRNA(MSTRG.1960.1)可能是与核黄素代谢信号通路相关的显著差异表达lncRNA,分别通过顺式调控其靶向基因APC-5和FLAD1来影响核黄素代谢信号通路。本试验初步鉴定出lncRNA(MSTRG.13995.2)-APC5和lncRNA(MSTRG.1960.1)-FLAD1可能是影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络。  相似文献   

浅谈非洲猪瘟生物安全防控策略     

魏玲  杨国淋 《猪业科学》2021,38(3):70-72

非洲猪瘟是猪的一种急性、烈性传染病,一旦发病,致死率达100%,会给整个养猪业和社会经济造成巨大损失,目前尚没有效疫苗和特效治疗药物,因此非洲猪瘟的生物安全防控对于预防该病的发生具有重要意义。文章从非洲猪瘟的病原学特点流行现状、诊断方法、疫苗研制和生物安全防控要点等几方面进行叙述,旨在为该病的生物安全防控提供一定的理论参考价值。  相似文献   

猪场生物安全体系中十个通道的设计应用     

辜新贵  汤立松  夏海峰  杨小康 《猪业科学》2021,38(3):100-103

2018年8月开始,非洲猪瘟在我国快速多点发生,该病是高度接触性传染性疾病,目前无有效的疫苗和药物控制,各大公司和养殖户开始了猪场生物安全体系的升级改造。两年后我国大部分猪场的成功复产,全国生猪出栏量的大幅提升,证明了生物安全措施巨大效力;同时在严格的生物安全措施下创新了精准剔除、快速复产等操作,进一步证明了生物安全措施的有效作用。文章主要介绍猪场生物安全体系中入口(大门)和出口(后门)最为关键防线处的通道设计,方便所有的生物安全操作能够高效落实,切断病原轻易进出猪场的途径。  相似文献