RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB     

唐志如  张友明  孙志洪  黄瑞林  印遇龙 《广西农业生物科学》2009,(3):417-421

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB,为发光光状杆菌基因敲除提供方法。采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上,获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB;采用Red／ET方法分别将Gentd基因和Aprar基因分别插入pTA-cipA和pTA-cipB的cipa和cipB基因中,并替换cipA和cipB基因部分序列,获得pTA-Gentalncip A和pTA-ApralncipB;pTA-GentalncipA通过BamH I酶切,从0．7％琼脂糖胶上回收获得GentalncipA,将GemaIncipA导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipA;pTA—ApraIncipB用EcoR I酶切,从0．7％琼脂糖胶上回收获得ApraIncipB,将ApmIncipB导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp．Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipB;42℃下热激去除突变菌中的质粒pASK-αβγA。克隆PCR和SDS—PAGE电泳结果表明发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB均被敲除。采用RED同源重组法成功地敲除了发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB。  相似文献   

绿僵菌Marho2基因功能初步分析     

陈丽  易萌  周江  孙云子  张传博 《热带作物学报》2018,39(2):325-331

绿僵菌广泛应用于农林害虫的防治,成功侵染寄主昆虫的过程中均伴随着细胞形态的变化,是细胞极性建立和骨架重排的结果。Rho家族中Rho2基因在参与调控细胞极性生长和正常的形态建成中发挥着重要作用。为了探究Marho2基因在绿僵菌生长发育与侵染致病过程中的功能,采用同源重组的技术构建Marho2基因的敲除载体,利用农杆菌介导转化法获得Marho2基因的敲除菌株(ΔMarho2),并对其进行分析。结果表明:与野生型菌株相比,Marho2基因调控绿僵菌的生长发育和致病力,Marho2基因的缺失降低了绿僵菌的毒力、产孢量及孢子萌发延迟,抑制了绿僵菌的湿热耐热性和抗紫外能力。   相似文献   

香蕉枯萎病菌4号生理小种β1-微管蛋白基因的功能分析     

刘远征  漆艳香  曾凡云  丁兆建  何壮  彭军  张欣  谢培兰  谢艺贤 《热带作物学报》2018,39(6):1153-1160

本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)β1-微管蛋白(β1-tub)基因,采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体,通过测定突变体菌株的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性,研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明：与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力明显减弱,但对多菌灵的抗性水平无明显变化。由此推测β1-tub基因可能在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要的作用。  相似文献   

Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用     

李鑫  李亚芯  戴建君 《中国畜牧兽医》2017,44(7):1934-1940

基因敲除是研究基因功能最直接的方法。对于大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂。Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟。作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项。大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考。  相似文献   

用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制     

王丹丹  唐雨婷  马月辉  王立刚  潘登科  蒋琳 《中国农业科学》2018,51(7):1390-1400

【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨 ZBED6 在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪（ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪（ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析,比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Sus_scrofa10.2为参考序列,用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因,对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪（P＜0.05）,与ZBED6-WT猪相比,ZBED6-KO猪肌纤维的宽度较宽,结缔组织较少,ZBED6基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用;测序结果显示,各样本获得至少10 G的数据量,每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上,表明测序饱和度良好,测序数据真实可靠;对测序数据进行分析,筛选到 184个差异基因,其中上调的基因114个,下调的基因70个,注释的141个,未注释的43个;差异基因层次聚类分析显示,ZBED6-KO组（x1、x3、x6）的3个个体表达模式相似,ZBED6-WT组（x2、x4、x5）的3个个体表达模式相似;GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目,33条显著的pathway通路,差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和RhoA信号等相关的通路;qRT-PCR 检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】首次以ZBED6-KO巴马小型猪为模型,利用RNA-Seq技术探究了ZBED6敲除对心脏发育和功能的影响,丰富了ZBED6 对心脏发育和功能的研究。  相似文献   

棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能验证及致病成因分析     

韩松  段兴鹏  张志东  左开井 《中国农业科技导报》2018,20(12):26-35

为分析棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能,利用基因同源重组原理将强致病力落叶型大丽轮枝菌Vd991菌株的VdTri15基因进行敲除。以Vd991菌株为对照,比较分析敲除突变体与野生型之间在生长速度、外分泌毒素、致病性等方面的差异,探讨VdTri15基因在致病过程中的功能。结果表明,VdTri15突变并不影响病菌的生长,但可引起其致病力减弱,分泌毒素种类发生改变。由此说明,VdTri15基因通过影响相关毒素的合成来影响大丽轮枝菌的致病力。  相似文献   

MarA和SoxS共同调节大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC的表达     

《中国兽医学报》2017,(12):2370-2377

利用Red同源重组技术构建大肠杆菌K12调控基因缺失菌株,探讨耐药发展过程中marRAB和soxRS对大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC表达的调控作用。在环丙沙星浓度递增的条件下诱导K12及调控基因缺失菌株,分别获得系列突变菌株,测定各菌株对其他药物的MIC,并检测靶位基因突变情况。利用RT-PCR方法检测诱导突变株中外排泵基因、调控基因、膜孔蛋白基因的表达水平。结果表明,K12正向调控基因(marA和soxS)缺失株在环丙沙星选择压力下仅获得环丙沙星敏感性降低的菌株,而负向调控基因(marR和soxR)在环丙沙星选择压力下可获得环丙沙星中介和耐药的菌株,且诱导突变株仅出现与耐药有关的gyrA单突变(Ser83Leu和Asp87His)。正向调控基因marA和soxS缺失后,外排泵基因表达水平变化不明显,而负向调控基因marR和soxR缺失后,marA和soxS的表达水平显著升高,引起外排泵基因表达水平显著升高,最高达到约13倍。当阻遏蛋白SoxR被敲除后,soxS的表达水平没有变化,而marA的表达水平显著升高,外排泵基因acrB表达水平也升高,说明在调控AcrAB-TolC外排泵基因表达方面,marRA与soxRS存在功能上的冗余,即当其中一个调控因子功能缺陷时,另一个调控因子可以发挥互补调控功能。因此,MarA和SoxS对三聚体系统AcrAB-TolC的正向调控作用是通过解除负向调控蛋白MarR和SoxR对其的阻遏作用实现的,MarRA和SoxRS共同调节外排泵AcrAB-TolC的表达水平。  相似文献   

香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析     

何壮  漆艳香  曾凡云  丁兆建  梁峻玮  张欣  彭军  谢培兰  谢艺贤 《热带作物学报》2019,40(12):2447-2455

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc 4）驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。  相似文献   

CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究     

张健  吴珍芳  杨化强 《华南农业大学学报》2023,44(3):333-339

【目的】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。【方法】用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型...  相似文献   

转基因动物在脂肪分泌研究中的应用     

高瑞峰  王哲  刘国文  张志刚  王贵 《中国畜牧兽医》2007,34(10):40-42

传统的观念认为脂肪组织是贮存能量的器官，随着瘦蛋白的发现，人们逐渐认识到，脂肪组织不仅是一个能量贮存器官，更是一个有高度活性的内分泌器官。人类和动物许多代谢性疾病都与脂肪异常代谢有关。通过转基因、基因敲除等手段，制造出了数个与脂肪代谢有关的生物学模型。人们已经发现和认识数个改变脂肪沉积、脂肪分配等方面的基因，并了解其分子机理和生理功能。作者的目的就是回顾近年来通过基因工程方法研究脂肪分泌的进展。  相似文献