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91.
【目的】利用转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统获得Tiki1基因敲除的兔模型,为研究Tiki1对动物早期发育作用机理提供兔源的动物模型。【方法】基于TALEN系统设计了靶向兔Tiki1基因的打靶载体,分别将10和50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到原核期的家兔受精卵胞质中,然后收集发育至囊胚期的胚胎,鉴定囊胚率和基因修饰效率,通过测序检验囊胚的基因突变。为了进一步获得Tiki1基因敲除兔,后续将50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到17个原核期的家兔受精卵胞质中,将受精卵分别移植到2只受体兔体内。【结果】注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率(64%)与注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率(57%)差异不大,但注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率(100%)显著高于注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率(14.3%)。测序结果表明,Tiki1基因的突变范围从1到28 bp缺失不等。经过胚胎移植共生出3只仔兔,其中有2只兔子能检测到基因突变。【结论】所建立的TALEN技术体系可以对家兔Tiki1基因进行高效的敲除。 相似文献
92.
大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。 相似文献
93.
随着基因组学、基因组编辑技术的迅速发展以及显微注射技术、体细胞克隆技术的广泛应用,一套新型的育种策略和方法已经逐渐形成。这一套新型育种策略和方法可以称为分子编写育种（breeding by molecular writing, BMW）。该方法可以高效创制新的遗传标记并对其进行快速验证,也可以对基因组进行精确到分子水平的编写并定向培养新品种,不仅能打破生殖隔离,跨物种的引入新的性状,更可以对物种内个体间基因组进行精确到单个碱基的插入、删除和替换。如外源基因的精确整合,内源基因的精确删除、替换,SNP位点的复制、删除或替换等。该技术的优点是：可以在极大的降低非预期效应的同时,快速高效的将多种有益性状聚合到同一品种内。分子编写可进行以下四方面工作：（1）新型育种标记的创制及验证;（2）跨物种分子编写;（3）基因组中碱基序列的删除;（4）物种内分子编写。该育种技术可以不通过有性杂交,只引入一个或几个目标基因或SNP,快速获得目标性状突出的遗传稳定新种质,然后结合常规育种方法育成新品种。该方法将实现真正的个体和群体水平的基因（或分子）杂交育种,获得分子杂种优势,能够高效的解决长久以来困扰育种工作的诸多难题,大大提高育种效率,尤其在畜禽育种中具有重要应用前景,将会是未来育种的发展方向。文章详细论述了分子编写育种技术的基本概念、研究手段、研究内容、研究现状并展望了该技术的应用前景,为动物育种、畜禽繁殖等领域的研究及从业人员提供了参考。 相似文献
94.
[目的]构建敲除传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5蛋白跨膜区序列的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。[方法]利用PCR技术分别扩增IBDVVP5基因的胞外片段和胞内片段,然后将2个片段及pET-28b（＋）同时相接,即载体一胞内片段一胞外片段一载体,构建了敲除跨膜区基因片段的VP5重组表达质粒pET—VP5-FC及改进后的pET—VP5-SC。将表达质粒转化BL21（DE3）,IPrG诱导后经Ni亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组蛋白。[结果]得到可溶性表达的IBDVVP5。[结论]为进一步研究VP5蛋白的结构与功能奠定了基础。 相似文献
95.
96.
我国科学家首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究,成功敲除了猪内源性PPARγ基因。近日,从中科院广州生物医药与健康研究院获悉,该院研究员赖良学研究团队与美国密歇根大学心血管研究中心陈育庆团队合作,首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究,成功敲除了猪内源性PPARγ基因。 相似文献
97.
98.
39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白.迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV) 39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚.本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系BmN细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度.进一步利用qPCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P＜0.01).为了进一步了解39K基因对BmNPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用.综上所述,可知39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强.本研究结果将为深入了解BmNPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料. 相似文献
99.
100.
双组分调控系统是细菌中普遍存在和非常保守的一种重要调节机制,研究水稻基腐细菌Dickeya zeae中双组分信号转导系统及其对致病性的调控具有重要的意义.本文通过同源重组、标记置换等分子遗传操作方法,成功敲除了水稻基腐病细菌双组分系统感受蛋白ExpS中的Hamp功能域,获得了Hamp功能片段缺失突变株及互补体.致病性及... 相似文献