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本研究旨在利用毕赤酵母(Pichia pastoris)系统融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10,CFP10)和早期分泌抗原靶6蛋白(earlier secreted antigen target 6,ESAT6),并评价其作为牛结核病外周血γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)体外释放实验特异性刺激剂来诊断牛结核病的应用潜能.通过PCR扩增cfp1 0-esat6融合基因,构建pPICZα A-(cfp10-esat6)重组质粒,电转化毕赤酵母GSll5,添加甲醇至终浓度1.0％,诱导3d,取培养上清进行SDS-PAGE分析,镍离子金属螯合亲和层析柱纯化目的蛋白,Western blot分析重组蛋白的免疫反应性;取纯化的融合蛋白CFP10-ESAT6作为刺激剂用于牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验,评价其牛结核病诊断价值.结果表明,目的蛋白(33kD)被成功分泌表达,该融合蛋白与抗CFP10、ESAT6、组氨酸标签和c-Myc4种单抗均发生特异性反应,具有较好的免疫反应性.165份奶牛外周血样品的IFN-γ检测结果表明,CFP 10-ESAT6融合蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)作为刺激剂,二者阳性符合率为82.3％,阴性符合率为78.8％.本研究利用酵母表达系统成功表达CFP10-ESAT6融合蛋白,并表现出更高的生物学活性,在牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为候选刺激剂,并能克服混合感染导致的PPD漏检问题,从而进一步提高检测的敏感性和特异性. 相似文献
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<正>为了对水稻瘟病进行良好防治,其全程综合防治技术应当以优选品种为基础,以做好栽培管理为重点,以药剂防治为核心。唯有保证水稻瘟病全程综合防治工作的科学合理,才能切实提高水稻产量与质量。1水稻瘟病症状根据稻瘟病的危害部位与生育期进行划分,可将其分为如下几种:(1)苗稻瘟。主要发生在3叶期前,秧苗靠近土表的基部呈灰黑色,上部呈淡红色最终枯死;(2)叶稻瘟。3叶期后的秧苗 相似文献
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牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素（Pokeweed mitogen,PWM）刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清（13.8μg/mL）配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL（30.5 pg/100μL）的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。 相似文献
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重组牛γ-干扰素单克隆抗体的研制 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BOIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb.结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γ mAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8和9G11.腹水的效价除单抗9G11外,其余效价都在1:80000以上;除5G4 mAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1.Dot-ELISA结果表明,所得单抗只与融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ反应,而不与其它重组细胞因子和对照细菌反应,显示其良好的特异性.Western blot显示所获单抗能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性务带.同时所获单抗均能与牛IFN-γ标准品反应.13株单抗均为针对rBoIFN-γ的特异性mAb,为进一步研究rBoIFN-γmAb在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定基础. 相似文献
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根据黑白花奶牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因的序列,通过RT-PCR扩增出BovIFN-γcDNA,并将其定向插入原核表达质粒pET-30a(+)和pGEX-6P-1,经DNA测序后,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别表达出大小在23和43 ku左右的融合蛋白。通过对诱导剂的浓度、诱导起始时间、诱导持续时间的筛选,对表达条件进行了优化,BL21(DE3)/pET-30a(+)-BovIFN-γ与BL21/pGEX-6P-1-BovIFN-γ的融合蛋白的相对表达量最高时可分别达到菌体总蛋白的60%和45%左右。使用纯化的融合蛋白rHis-BovIFN-γ和rGST-BovIFN-γ进行细胞病变抑制试验,证实表达产物具有较高抗病毒感染活性,在牛肾细胞(MDBK)上抑制水疱性口炎病毒的活性分别为2.15×107和1.21×105U·mg-1。 相似文献
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为利用牛白细胞介素-4 (BoIL-4)的特异性单克隆抗体(MAb)建立检测BoIL-4的双抗体夹心ELISA方法,以多种ELISA方法对7株抗BoIL-4的单抗进一步筛选,得到反应最佳的2株单抗8B7和4A10,以A9表达的重组BoIL-4为阻断剂的阻断ELISA试验中,表明这2株单抗也可识别所构建的细胞系A9表达的重组BoIL-4。以单抗8B7作为包被抗体,以标记了HRP的单抗4A10作为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA方法可检测大肠埃希菌、毕赤酵母和Flp-In-293细胞系3种表达系统表达的重组BoIL-4,最低检测限分别为0.25、8和2 ng·mL-1,且对A9细胞系上清中表达的BoIL-4检测效果和特异性良好。该研究建立的BoIL-4双抗体夹心ELISA方法为深入研究BoIL-4、开发BoIL-4 ELISA检测试剂盒奠定了基础。 相似文献