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【目的】实时定量 PCR结果的精确性在很大程度上取决于选择的内参基因的稳定性。通过评估候选管家基因的表达稳定性,筛选出用于牛奶子研究的最佳内参基因。【方法】设计简并引物从牛奶子中克隆12个潜在的内参基因片段,包括14-3-3、18S核糖体 RNA(18SrRNA)、β-actin (Actin)、延长因子1-α(EF1-α)、真核起始因子4A (eIF4A)、3－磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、RNA聚合酶－Ⅱ(RPⅡ)、60S核糖体蛋白(RPL7)、翻译延长因子2(TEF2)、泛素连接酶 E2(UBCE)、泛素(UBQ)和泛素延伸蛋白5(UBQ5)。采集牛奶子5个不同器官(根、茎、叶、花和红果)、4个成熟期的果实(绿果、黄果、深粉果和完全成熟的红果)、2种激素(脱落酸、赤霉素)处理4个时间点的绿果、热处理4个时间点的离体叶片、幼苗盐胁迫2个时间点的根茎叶,应用实时荧光定量 PCR 技术检测12个内参基因在各样品中的表达情况,采用基于 CT值的 geNorm、Normfinder和 BestKeeper及 CT比较4种算法评价这些内参基因的稳定性,最终的排名则由 RefFinder算法产生。【结果】器官组稳定性好的前2位内参基因为 UBCE和 RPL7,果实成熟期组排名前2的为eIF4A和UBCE,激素处理组排名前2的为eIF4A和UBCE,非生物胁迫组排名前2的则为 Actin和 EF1-α,综合分析所有样品排名前3位的是 eIF4A、RPL7和 UBCE。分别用筛选出的稳定的eIF4A、RPL7、UBCE和不稳定的 RPⅡ作为内参基因评价目的基因八氢番茄红素合成酶基因 EutPsy 在果实成熟过程中的表达,结果显示分别以3个稳定的内参基因为单内参基因与以 eIF4A 同 UBCE 组合做内参基因所得到的结论一致,而 RPⅡ给出的则不同。【结论】在应用荧光实时定量 PCR技术研究牛奶子基因转录表达时,通常情况下eIF4A、RPL7和 UBCE相对于其他9个候选内参基因更为可靠。研究结果为牛奶子及胡颓子属其他物种的基因表达分析奠定基础。 相似文献
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密花胡颓子果实主要类胡萝卜素组分及含量分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】胡颓子属植物牛奶子果实大量积累番茄红素,高达番茄的17倍,而该属中果实大、口感好的密花胡颓子果实中主要类胡萝卜素组分及含量尚不清楚。研究利用高效液相色谱法检测德甜密花胡颓子1号和2号2个品种的成熟果实中主要类胡萝卜素组分及含量。【方法】以甲醇∶氯仿=1∶2（v/v）提取果实中类胡萝卜素,高效液相色谱法（Agilent 1260）进行类胡萝卜素定性定量分析。色谱条件：YMC C30分析色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）;流动相为A（100％甲醇）、B（含0.2％乙酸铵的80％甲醇）和C（甲基叔丁基醚）,采用梯度洗脱,洗脱程序为0-6 min由95％A+5％B组成,7 min时梯度改变为80％A+5％B+15％C,12-32 min梯度改变为30％A+5％B+65％C,48-50 min梯度改变为95％A+5％B,维持该浓度至分析结束（60 min）,流速为1 mL•min-1,柱温25℃,进样量20 μL,检测波长450 nm。【结果】德甜密花胡颓子1号和2号2个品种的成熟果实均积累了大量的番茄红素和β-胡萝卜素,品种间的积累量存在差异。其中德甜密花胡颓子1号果实中β-胡萝卜素积累量达（231.84±16.00）µg•g-1DW,是目前已报道植物中β-胡萝卜素含量高的物种之一;德甜密花胡颓子2号品种果实中的番茄红素含量高达（1 054.10±29.19）µg•g-1DW,是番茄果实（150 µg•g-1DW）的7倍。【结论】密花胡颓子果实中高积累番茄红素和β-胡萝卜素,是继牛奶子之后,在胡颓子属中发现的又一高积累特异类胡萝卜素的野生植物资源,为今后研究果实高积累番茄红素和β-胡萝卜素的分子机理提供了理想的研究材料。 相似文献
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