mRNA的纯化方法对文库质量的影响     

王丽娜  王丽芳  于淼  公欣桐 《分子植物育种》2018,(16)

高质量mRNA的分离和纯化是转录组文库构建和基因表达调控等生物学实验的前提。为了调取较完整、纯度较高的mRNA,本研究采用磁性分离技术调取mRNA,磁性复合微粒通过其表面的功能团与oligo(dT)_(25)相偶联,形成杂交体-磁珠复合体,外加磁场来实现mRNA的快速分离,并经过不同试剂纯化后得到高质量的mRNA,用于构建转录组文库。结果表明:mRNA被调取后,使用不同的缓冲液纯化时对mRNA质量影响较大,经多次试验验证:结合缓冲液为2.5 mol/L LiCl,洗脱缓冲液采用0.1 mol/L LiCl和1%Li DS相结合进行纯化时,检测结果显示文库条带位于400~600 bp之间,条带大小符合上机要求。高质量转录组文库的构建为高通量测序和基因克隆等实验提供帮助。  相似文献   

转BpGH3.5基因白桦优良株系选择     

于嘉俐  王楚  公欣桐  李继唐  刘桂丰  姜静 《北京林业大学学报》2019,41(9):81-89

目的植物生长素酰胺合成酶基因家族（GH3s）为典型的植物生长素初级/早期响应基因，多数家族基因可通过调节植物体内游离IAA的浓度实现对生长发育的调控。故此，采用基因工程育种技术将BpGH3.5正义链、反义链导入白桦基因组中，预期获得速生转基因白桦新品种。方法以7年生白桦转BpGH3.5基因的54个正、反义链株系及对照（WT）株系为研究对象，测定树高、胸径及材积等生长指标，采用PCR及qRT-PCR技术分别检测转正、反义链各5个株系目标基因的遗传稳定性及相对表达量，同时采用ELISA技术测定游离IAA含量。结果PCR扩增显示，转基因株系中的nptⅡ外源基因均为阳性；qRT- PCR分析显示，5个转正义链株系中BpGH3.5基因表达量均显著高于WT株系，相反，5个转反义链株系中内源BpGH3.5基因表达量均显著下调，即BpGH3.5反义链导入白桦基因组后干扰了白桦BpGH3.5基因的表达。内源游离IAA含量测定显示，转BpGH3.5正义链株系的IAA含量低于或显著低于WT株系，5个转反义链株系均显著高于WT株系（P < 0.01），其IAA含量均值高于WT株系的52.26%。7年生转BpGH3.5白桦的树高、胸径及材积生长性状在株系间的差异达到了极显著水平（P < 0.01），在树高、胸径及材积生长指标高于群体均值的转基因株系中，转反义链株系占80%以上，认为BpGH3.5反义链导入白桦基因组中通过抑制BpGH3.5基因的表达，削弱IAA氨基酸化的能力，进而释放更多游离IAA从而促进白桦的生长。采用主成分分析法，选出10个速生的转反义链株系，这些株系的树高、胸径及材积均值较群体均值分别高8.55%、19.28%、50.42%，材积的平均遗传增益为36.3%。上述入选株系为后续转BpGH3.5白桦的环境释放提供参考。结论BpGH3.5反义链导入白桦基因组中，能够抑制BpGH3.5基因的表达，同时释放更多游离IAA而促进白桦的生长，采用主成分分析法，选出10个优良株系。   相似文献