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CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。 相似文献
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水稻叶鞘原生质体转化体系的构建及Pik-H4和AvrPik-H4蛋白的瞬时表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】探索水稻叶鞘原生质体最佳游离时间以及转化时间,提高瞬时表达效率,在蛋白水平对目的基因进行检测且大批量表达。探索该系统表达抗稻瘟病蛋白Pik1-H4、Pik2-H4及无毒蛋白Avr Pik-H4的可行性,对目的基因的功能进行分析。【方法】以高抗稻瘟病品种H4及对照品种中二软占作为试验材料,利用1/2 MS培养基种植水稻幼苗25℃恒温培养7—10 d。利用纤维素酶及离析酶对水稻叶鞘进行酶解,血球计数板分别统计游离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h的细胞数目获得最佳的酶解时间。将目标基因Pik1-H4、Pik2-H4及Avr Pik-H4分别与GFP融合,构建瞬时表达载体,利用PEG介导转入水稻叶鞘原生质体。设置转化10、12、14、16、18、20、22和24 h,分别提取细胞总RNA,UBQ管家基因为对照,设计GFP特异性扩增引物,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测GFP的相对表达量,探索最佳的转化时间。通过激光共聚焦扫描显微镜对目标基因进行亚细胞定位观察,推测基因功能。提取细胞总蛋白,以Anti-GFP为一抗用Western blot对目标蛋白表达进行验证。【结果】相对室温土壤栽培,营养丰富且均衡的1/2 MS培养基恒温种植的水稻幼苗质量更优质,活力更高。游离时间的长短对游离效率影响较大,游离的最佳时间为4—6 h,在3—4 h细胞游离数目增长速度最快,4—6 h细胞数量趋于平稳,6 h以后细胞总量呈现下降趋势,特别是7 h以后,显微下细胞碎片增多,细胞死亡速度加快。检测GFP的相对表达量,获得最佳转化时间为14—16 h,16 h达到最高值,之后逐渐下降。随着时间的推移,荧光显微镜下观察到GFP蛋白发出的荧光逐渐淬灭。亚细胞定位观察发现Avr Pik-H4蛋白主要被定位于水稻细胞膜上,初步推测是一种膜蛋白,通过某种形式运输到宿主细胞作为激发子触发一系列反应。Pik-H4是高效广谱抗稻瘟病基因,分为Pik1-H4和Pik2-H4两个部分,Pik1-H4主要定位在内质网,Pik2-H4主要定位在质体,从定位结果初步推定Pik1-H4可能主要参与Avr Pik-H4蛋白的识别反应,Pik2-H4主要起到调控下游抗病的作用。Western blot结果显示目标蛋白表达成功,分子大小正确。Pik1-H4和Avr Pik-H4的表达量高于Pik2-H4,说明分子量的大小不是影响转化效率的关键因素。【结论】水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统具有高效快速的特点,通过对游离及转化时间的探索为水稻瞬时表达体系的广泛实践应用提供参考。目标基因的成功表达为Pik-H4与无毒蛋白互作机制的研究提供了有价值的理论依据。 相似文献
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