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基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。 相似文献
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非表达因子基因(NPR1)是植物系统获得抗性的激活子,也是植物响应病原菌侵染过程中的核心因子之一,在植物抗病性方面发挥着非常重要的作用。为明确高粱NPR1基因家族成员及SbNPR1的表达特性,本研究通过生物信息学及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对高粱NPR1基因家族进行鉴定和表达分析。结果表明,共鉴定到5个高粱NPR1基因SbNPR1~SbNPR5,其氨基酸序列长度介于480~621 aa之间,理论分子量介于50.496 81~67.648 06 kDa之间,理论等电点介于5.64~6.11之间;系统进化分析显示,SbNPR1与甘蔗Sh253P03亲缘关系最近;基因结构分析表明,该家族各个成员之间的外显子和内含子数量差异变化较小;RT-qPCR分析表明,SbNPR1基因在高粱不同器官中的表达具有组织特异性;经激素独脚金内酯(GR24,1 μmol·L-1)和水杨酸(SA,1 mmol·L-1)处理后,SbNPR1的表达分别被抑制和诱导;20%的聚乙二醇(PEG6000)和250 mmol·L-1的NaCl处理下,SbNPR1的表达呈现先升高后降低的趋势,在0.5 h表达量达到最大值,之后下调;而经甘露醇(D-mannitol,300 mmol·L-1) 处理后,SbNPR1基因表达量在3 h后开始下降;高粱经病原相关分子模式(PAMPs)flg22(100 nmol·L-1) 和几丁质(Chitin, 8 nmol·L-1)处理后,SbNPR1受到flg22的诱导表达,在12 h时表达量最高,而在Chitin作用下,SbNPR1的表达受到抑制。本研究为进一步探索NPR1家族在调节高粱抗性、信号转导、植物激素以及胁迫调控等过程中的作用提供了基础。 相似文献
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为研究高粱转录因子BZR1基因家族的表达特征,以高粱BTx623为材料,通过生物信息学及实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)技术对高粱BZR1基因家族进行鉴定和激素应答分析。结果表明,在高粱基因组中共鉴定到9个BZR1基因家族成员,根据染色体位置命名为SbBZR1-1~SbBZR1-9,其氨基酸序列长度在191~716 aa之间,理论分子量大小在20.99~80.41 kD之间,理论等电点在4.75~10.62之间;系统进化树分析显示,高粱BZR1基因家族与单子叶水稻和玉米的同源性为67%~100%;该家族各个成员之间外显子和内含子的数量差异较大。SbBZR1-3、Sb-BZR1-4和SbBZR1-9基因在高粱不同器官中的表达具有组织特异性;经200 μmol/L脱落酸处理后,SbBZR1-3基因的相对表达量逐渐升高,在9 h时达到最大,而高粱SbBZR1-4和SbBZR1-9基因的表达受到显著抑制;SbBZR1-3和SbBZR1-4基因在1 μmol/L油菜素内酯诱导下呈降低-升高-降低的表达趋势,但SbBZR1-9基因的表达受到显著抑制;在1 mmol/L γ-氨基丁酸和100 μmol/L褪黑素处理下,SbBZR1-3、SbBZR1-4及SbBZR1-9基因均显著上调表达;经10 μmol/L吲哚乙酸处理后,Sb-BZR1-3基因呈先升高后降低的表达趋势,SbBZR1-9基因的表达受到显著抑制,SbBZR1-4基因呈升高-降低-升高-降低的表达趋势。表明高粱BZR1基因家族在激素应答过程中具有重要作用。 相似文献
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为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功能研究提供了基础。 相似文献
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KNOX基因家族是植物生长发育过程中所特有的一类转录因子,其在植物的形态建成方面发挥着重要的作用。为研究高粱KNOX基因家族特征及SbKNOX22的表达特性,本研究利用生物信息学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的分析方法,对高粱KNOX基因家族进行了鉴定和表达分析。结果表明,在高粱中共鉴定到23个KNOX基因(SbKNOX1~SbKNOX23),亚细胞定位显示均定位于细胞核中,氨基酸序列长度介于184~802 aa之间,分子量大小介于20.23~86.14 kDa之间,理论等电点介于7.28~4.76之间,高粱KNOX基因家族蛋白均属亲水性蛋白,分布在8条染色体上。系统进化结果显示,高粱KNOX基因家族分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类;基因结构分析表明,Class Ⅱ类中各亚类家族成员之间的外显子和内含子数量存在较大差异;Motif分析显示,Homeobox KN结构域最为保守。qRT-PCR分析表明,SbKNOX22在高粱叶片中表达,水杨酸处理6 h时表达量最高,PEG 6000和甘露醇模拟干旱胁迫处理0.5 h后表达量开始降低,NaCl胁迫处理9 h时表达量最高。本研究结果为进一步探索KNOX家族在调节高粱生长发育、信号转导和植物激素调控等过程中的作用提供了基础。 相似文献
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大型真菌在生物资源中具有重要地位,同时在维持生态平衡和物质循环方面也具重要作用.由于其生长发育快、生物转化率高,且能高效将无机物转化成富含硒、锗、高氨基酸等功能食用菌产品,对于大型真菌的产品开发愈来愈受欢迎.已有研究表明,大型真菌在快速转化生物物质时,对人体有害的重金属、毒素等大量物质也被富集.且自大型真菌富集重金属的... 相似文献
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为研究马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）衣壳蛋白（coat protein,CP）在体外表达及CP重组蛋白的晶体生长条件,通过Eco R Ⅰ/Hind Ⅲ酶切及连接技术构建pET-32a-PVY CP原核表达载体,对PVY CP的诱导剂浓度进行优化,利用蛋白质纯化及脱盐技术对PVY CP进行纯化和脱盐,并分析PVY CP重组蛋白的晶体生长条件。结果表明,成功构建了pET-32a-PVY CP原核表达载体;PVY CP在大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞BL21(DE3)原核表达系统中,于16℃下利用0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达可获得高浓度的PVY CP可溶性蛋白;PVY CP重组蛋白在二水甲酸镁处理下可生长出棒状结构晶体。 相似文献
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为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。 相似文献
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