FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析     

付元芳  卢曾军  曹轶梅  张小丽  郭建宏  刘在新  才学鹏 《甘肃农业大学学报》2008,43(6)

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.  相似文献   

口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立   总被引：2，自引：0，他引：2  

蒋韬  梁仲  陈涓  何继军  吕律  马维民  刘在新  刘湘涛 《中国农业科学》2008,41(11)

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.  相似文献   

Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因和牛α-干扰素基因的融合表达   总被引：1，自引：1，他引：1  

独军政  常惠芸  宋立荣  李冬  丛国正  林彤  邵军军  刘在新  谢庆阁 《中国兽医科技》2005,35(2):81-84

将Asia Ⅰ型口蹄疫病毒YNBS／58株VP1基因和去信号肽的牛α-干扰素基因共同亚克隆于原核表达载体pET-28a中，转化BL21后经IPTG诱导，实现了重组融合蛋白VP1-BoIFN—α-在大肠埃希氏茵BL21中的高效表达，表达产物经SDS—PAGE和western-blotting分析，重组的VP1-BoIFN—α蛋白分子质量约为46ku，与预期大小相符。薄层扫描分析显示，重组蛋白VP1-BoIFN—α的表达量占茵体总蛋白的30％，且以包涵体的形式存在。包涵体提取物用8mol／L尿素溶解后，在变性条件下利用Ni—NTA柱对VP1-BoIFN—α-融合蛋白进行了纯化。  相似文献   

基因芯片技术及口蹄疫病毒基因芯片研究进展     

王建东郭建宏  杨春生刘在新 《动物医学进展》2007,28(B08):37-40

口蹄疫的暴发与流行给世界各国的畜牧生产、社会经济和国际贸易构成严重威胁并造成巨大的经济损失，经典的血清学和PCR检测方法越来越不适应进出口动物检疫的快速、准确、高通量的要求。建立一种快速的诊断方法，使其在很短时间能够区别各血清型口蹄疫和其他水泡性疾病是非常必要的。口蹄疫病毒基因芯片包括155个寡核苷酸探针，总长35bp-45bp，设计在VP3-VPl-2A区，既有共有的病毒型别，也包含特异的血清型别。这项技术的优点是能在单一的芯片上检测多元病原体。  相似文献   

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建   总被引：2，自引：0，他引：2  

方先珍刘光清  刘在新李平花 谢庆阁 《中国兽医科技》2004,34(5):7-10

利用RT—PCR和3’cDNA末端快速扩增(RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的2个重叠cDNA片段，将其分别插入到载体pcDNA3．1zeo( )和pGEM—T—Easy中，然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至pcDNA3．1zeo( )载体，经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明，重组质粒(pcDNA3．1／FMDV)携带了FMDVOH／99基因组全长cDNA序列。  相似文献   

超过滤技术在病毒浓缩中的应用     

刘在新 《中国兽医科技》1990,(2):39-40

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我国O型Mya-98口蹄疫病毒流行情况与毒株分析     

何继军  杨亚民  马维民  尚佑军  吕律  郑海学  靳野  郭建宏  刘在新  刘湘涛 《中国动物检疫》2014,31(5):45-51

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国外口蹄疫疫苗抗原检测研究进展     

刘在新 《国外兽医学(畜禽疾病)》1992,13(3):5-6

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口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达     

马江涛  卢曾军  曹轶梅  郭慧琛  郭建宏  祝秀梅  刘在新  杨孝朴 《甘肃农业大学学报》2007,42(4):5-10

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.  相似文献   

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列     

刘光清  刘在新  谢庆阁 《中国兽医学报》2003,(6)

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。  相似文献