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利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒. 相似文献
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本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳（N）蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是世界范围内威胁猪健康的主要病原之一,其所引起的病毒病也是当今养猪业最重要的猪病。在过去研究多集中在病毒侵入宿主细胞必须识别的许多病毒受体和侵入介质,但病毒作用物的分子机制仍不清楚,以致难以研制出有效的疫苗。本研究的主要目的是鉴定sialoadhesin(Sn)受体作用的主要病毒作用物,Sn受体是巨噬细胞上PRRSV的主要受体。为此本试验构建了可溶性Sn,其能通过唾液酸依赖途径与PRRSV结合,从而中和巨噬细胞感染的PRRSV,因此Sn是巨噬细胞上重要的PRRSV受体。虽然唾液酸作用于GP3、GP4和GP5整个糖蛋白,但只有PRRSVM/GP5糖蛋白复合物才能作为Sn的配体。试验证明了Sn具有唾液酸结合力及GP5存在唾液酸,该研究结果不仅有助于更好的了解PRRSV的生物特性,更能为研究新的PRRSV疫苗提供了主要思路。 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。 相似文献
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小反刍兽疫病毒H基因的原核表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株的H基因序列,设计上下游引物并添加BamH I酶切位点,以含有小反刍兽疫病毒H基因的Topo-PPRVH质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆于pEASY-T载体中,用BamH I单酶切后将目的片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,核酸序列分析证明.成功构建了PPRV H原核表达质粒pET-32a-H.将pET-32a-H重组质粒转化大肠杆茵 BL21(DE3)进行融合表达.经SDS-PAGE电泳,可见H蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为87 Ku,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量达到茵体总蛋白的38%,占包涵体蛋白的80%以上.Western blot鉴定表明,所表达的重组蛋白能被抗组氨酸单抗、抗PPRV标准阳性羊血清及抗PPRV疫苗的羊血清所识别,具有良好的免疫原性. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arteriviridae),是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrom,PRRS)的病原,PRRS的流行给养猪业造成了巨大的经济损失。作为PRRSV基因组编码的第2个蛋白质,Nsp1可以通过C末端的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(papain-likecysteine protease,PCP)将自己从Nsp2下游切割下来。虽然已知Nsp1与病毒毒力有关,但其在病毒感染过程的确切作用仍不清楚。本试验描述了PRRSV Nsp1天然的同型二聚体晶体结构,通过采用一个类似组装了几个已知核酸酶的折叠(其在体外用锰离子可激发较强的核酸酶活性)来研究了PRRSV Nsp1N末端的体系结构。通过标记的核酸酶,识别Nsp1的关键特性:具有C端木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶区域(负责将Nsp1β从Nsp2上自行解离下来),连接NTD和PCP的接头(LKD),以及C末端的延展区(CTE),推测其位于PCPβ区域的结合位点相对较稳定。综合以往关于核定位的报道,多关注于Nsp1β的自处理模式及预测生物学功能,本研究为开发多靶位新药提供了模板。 相似文献
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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)是呈世界性分布的猪病-断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原之一。免疫系统的变化在PMWS的致病机理中被认为是最关键的。先前的研究结果表明,细胞因子的分布可提示T细胞的免疫抑制,并且认为IL-10在PCV2感染中起了很重要的作用。9只11~12周龄的商品猪来自西班牙西北部的发生过PMWS疫情的某商品猪场,4只健康,5只患过PMWS(通过PCR和实时荧光定量PCR检测血清),均剖检取脾。通过间接荧光抗体试验检测脾中包括分泌IL-10在内的免疫细胞的表型和分布。结果脾中的CD163+、CD4+和CD8+亚群可分泌产生IL-10,PMWS患猪的IL-10生成细胞数高于健康猪,且在外周淋巴组织鞘中的IL-10生成细胞没有感染PCV2。这是首次应用间接荧光抗体试验研究患PMWS猪中的IL-10生成细胞,该试验为进一步研究IL-10在疾病致病机理中的作用提供了资料。 相似文献
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尽管断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)多感染8～16周龄的仔猪,许多研究结果表明,PMWS也可影响育肥猪群。本试验主要研究不同临床症状的PMWS育肥猪群猪圆环病毒2型(PCV2)抗原和抗体效价的动态变化。从3个育肥猪群(来自Swedish猪场的A、B猪群和Norwegian猪场的C猪群)各收集40份血样本用以分析血清PCV2抗原、抗体和唾液皮质醇。虽然A、B猪群由同一母猪群,但其PMWS症状有所不同。结果表明,A、B猪群最初的PCV2抗原相同。在A猪群进入育肥期2周后,PCV2抗原水平达到最高;PCV2抗体水平也较高,达到107/mL;随着PMWS的发展,PCV2抗体水平也随之消长。B猪群表现为PCV2抗体水平升高到一定水平并维持整个试验期,而PCV2抗原水平则稳定下降。在育肥期的前5周,C猪群未感染PMWS,从而未检测到PCV2抗体,即使PCV2DNA量也很低,然后PCV2抗原水平有小幅上升,PCV2抗体水平也随之上升。A、B猪群的PCV2为PCV2b,而C猪群为PCV2a。C猪群的唾液皮质醇水平低于A、B猪群。A、B猪群与C猪群最大的不同之处在于PCV2的基因型不同和因PCV2感染时间不同导致的感染分布部位不同。临床型PMWS可表现低血清抗体水平,且高PCV2抗体水平不一定发展为临床型PMWS。由此可知,A猪群可能是因管理不善从而导致PMWS的发生,提示应重视合适的卫生管理和常规疾病预防措施的重要性。 相似文献
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猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20 ℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。 相似文献
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