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本研究旨在阐明牦牛KDM4A基因的表达特性及其在牦牛卵母细胞和颗粒细胞中的作用。采集牦牛心、肝、脾、卵巢、肺、肾、睾丸、小肠、子宫、胃、大脑组织,以GenBank上已发布的黄牛KDM4A基因序列设计引物,利用RT-PCR方法扩增克隆牦牛KDM4A基因及检测其在牦牛各组织中的表达谱,并使用在线软件ExPASY分析KDM4A基因的结构和功能。采用实时荧光定量PCR法检测牦牛不同时期卵母细胞和颗粒细胞中KDM4A基因的表达水平。结果表明,本研究克隆得到牦牛KDM4A基因3 289bp的cDNA序列。牦牛KDM4A核苷酸序列与其它哺乳动物的遗传距离较近,表明KDM4A基因在进化中较为保守。牦牛KDM4A基因CDs区为3 201bp,编码1 066个氨基酸残基,相对分子质量122.48ku。KDM4A蛋白为亲水不稳定的酸性蛋白,无跨膜区和信号肽,二级结构主要包含α-螺旋和无规卷曲,与三级结构分析结果一致。KDM4A基因在所选牦牛组织样本中均有表达,其中在卵巢、脾和睾丸中表达量最高。牦牛KDM4A mRNA在MII期颗粒细胞中表达量显著高于在MI期和GV期颗粒细胞中的表达量(P0.05),GV期卵母细胞中,KDM4A mRNA的表达水平显著高于在MI期和MII期卵母细胞中的表达量(P0.05)。综上表明,本研究成功克隆了KDM4A基因及其在牦牛卵母细胞和颗粒细胞成熟过程中mRNA表达水平的差异,表明KDM4A基因在卵母细胞及颗粒细胞成熟过程中发挥一定作用。 相似文献
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旨在选择小鼠卵巢组织中合适的内参基因,为研究卵巢发育过程中基因表达提供可靠数据。以不同年龄(0日龄、3周龄、5周龄、8周龄)小鼠卵巢组织为试验材料,Trizol法提取样本总RNA,并合成cDNA,根据已报道的小鼠(Mus musculus)各组织中相对稳定表达的8个常见内参基因(Gapdh、β-actin、β-tubulin、18S rRNA、16S rRNA、H2afz、Ubc、Rpl13a)的GenBank登录序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法构建卵巢cDNA等梯度(1∶10)稀释后的标准曲线;利用geNorm分析候选内参基因的表达稳定性(M);NormFinder筛选表达最稳定的内参基因;BestKeeper计算qRT-PCR结果的标准差(SD)和变异系数(CV),从而预测候选内参基因的稳定性。结果表明,8个内参基因的引物特异性较强,具有良好的线性关系;候选内参基因的表达稳定度排序:Gapdh=β-actin>18S rRNA>Ubc>16S rRNA> H2afz>Rpl13a>β-tubulin;其中Gapdh表达稳定性最好,且标准差及方差系数最小(SD:0.32,CV:1.95),H2afz标准差及方差系数最大(SD>1.0,CV:5.76)。综上表明,本研究成功获得出生后小鼠卵巢发育过程中稳定表达的内参基因(Gapdh和β-actin),可作为其基因表达研究中的最佳候选内参。 相似文献
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旨在研究KDM2A在牦牛睾丸发育和精子发生中的作用,为提高牦牛繁殖性能提供理论依据。提取牦牛胎儿时期(5～6月龄)、幼年时期(1～2岁)、性成熟时期(3～4岁)睾丸的总RNA,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测KDM2A在牦牛睾丸中的表达情况。结果显示:3个时期牦牛睾丸中均有KDM2A基因表达,且表达量随年龄增长呈递增趋势,性成熟时期睾丸中KDM2A mRNA与蛋白质的表达量均显著高于胎儿时期和幼年时期;胎儿时期仅在精原干细胞及支持细胞中表达,幼年和性成熟时期睾丸中精原细胞、支持细胞、初级精母细胞、圆形精子及精子形成期均呈阳性。表明KDM2A在牦牛不同发育阶段的睾丸中表达,在牦牛睾丸发育及精子生成中发挥重要作用。 相似文献
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旨在分析成年健康牦牛和犏牛(3～4岁)睾丸组织中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,从而探究lncRNA与犏牛雄性不育机制的关联性,为解释犏牛雄性不育的机理提供理论依据。采集成年(3～4岁)健康牦牛、犏牛各3头的睾丸组织,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异的lncRNA,通过对差异显著的lncRNA与mRNA位置关系以及结合能的判定预测顺式作用(cis)和反式作用(tran)的靶基因,并进行GO、KEGG功能分析。结果表明,共得到牦牛和犏牛候选lncRNA转录本分别为20 363和24 133个,两个文库筛选出6 178个显著差异lncRNA,其中有2 470个在犏牛睾丸组织与牦牛比较上调,3 708个下调。筛选得到差异显著lncRNA的候选靶基因2 676个,这些基因参与58个功能分类,共涉及306条通路;其中主要富集的通路包括轴突指导、内吞、Hedgehog等信号通路。综上表明,部分lncRNA介导的靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11与犏牛雄性不育相关,lncRNA在犏牛的生殖发育中对其雄性不育具有重要的调控作用。利用RNA-Seq技术筛选出成年牦牛和犏牛睾丸组织lncRNA,并进行差异分析,为探讨犏牛雄性不育的机制提供更完善的转录组数据。 相似文献
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KDM2B基因克隆及其在牦牛组织和卵母细胞减数分裂过程中的表达研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在克隆牦牛组蛋白去甲基化酶2B(Lysine-specific histone demethylase 2B,KDM2B)基因,检测其在牦牛不同组织及其在卵母细胞减数分裂过程中的表达水平,从而为研究KDM2B基因在牦牛减数分裂中的作用机制提供试验依据。牦牛屠宰后,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、胃、肌肉、卵巢、睾丸和子宫组织样品,分别提取各个样本的总RNA。另选择3~5周岁的健康牦牛,采集卵巢后,抽取卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complex,COCs),透明质酸酶作用后,获得卵母细胞和颗粒细胞,利用RT-PCR扩增得到KDM2B基因CDS区序列,实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测KDM2B基因在不同组织中的表达水平。体外培养获得GV、MI、MII 3个时期COCs,用qRT-PCR法检测KDM2B基因在卵母细胞减数分裂过程中的表达规律。结果表明,KDM2B基因CDS区长为3 930bp,编码1 309个氨基酸,与牦牛已有预测序列相比,属于长型转录本。与牛、绵羊、山羊的同源性较高,与斑马鱼和鸡的同源性较低。KDM2B基因在牦牛的各个组织中均有表达,其中脾、子宫、睾丸和卵巢的表达量较高。在MI期卵母细胞中,KDM2B基因的表达水平显著高于GV期和MII期(P0.01)。在卵丘颗粒细胞中,KDM2B基因的表达水平随减数分裂的进行而显著增加(P0.01)。本研究为进一步研究牦牛卵母细胞减数分裂机制及改善牦牛繁殖效率提供基础资料。 相似文献
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旨在构建干扰胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-II,IGF-II）的重组质粒载体,研究IGF-II对牦牛睾丸支持细胞的影响。本研究设计并合成针对牦牛IGF-II的shRNA寡核苷酸,并将其克隆至pLKO.1质粒载体上,转染牦牛睾丸支持细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法检测IGF-II基因和蛋白的表达,采用细胞生长分析仪分析支持细胞的增殖凋亡情况。结果显示,干扰牦牛IGF-II表达的pLKO.1质粒载体构建成功,其可在睾丸支持细胞中稳定表达,且能有效抑制IGF-II基因的表达。与对照组相比,pLKO.1-shRNA2的干扰效率最显著,IGF-Ⅱ的表达量下调至19.1%（P<0.05）,且pLKO.1-shRNA2可使内源性IGF-II蛋白的表达量减少76.3%（P<0.05）。pLKO.1-shRNA2质粒转染及筛选得到的稳定细胞株培养48 h后的细胞分裂增殖活性显著低于对照组（P<0.05）。qRT-PCR结果显示,干扰内源性IGF-II后,睾丸支持细胞中的IGF-I和IGF-IIR基因表达出现了显著的上调（P<0.05）,IGF-IR与Bcl-2的表达出现了显著的下调（P<0.05）。综上表明,牦牛IGF-II干扰质粒构建成功,其转染至牦牛睾丸支持细胞有效抑制了IGF-II的表达,改变了IGF-IR与Bcl-2的表达模式,潜在影响了牦牛支持细胞的分裂增殖,具体作用机制有待进一步研究。 相似文献