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构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达质粒,并探讨其对小鼠的免疫原性。本试验采用PCR扩增pMD18TF1L克隆质粒的F1L基因并将其克隆至pVAX1载体中,构建真核表达质粒并转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光检测F1L基因在MDBK细胞中的转录和表达。将构建的pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,通过间接ELISA、MTT和FACS法对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建了真核表达质粒pVAX1-F1L,并能在MDBK细胞中获得较高水平的表达。免疫小鼠后诱导的特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖反应、CD4~+、CD8~+细胞百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于pVAX1组和PBS对照组。因此,制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。 相似文献
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为研究所构建羊口疮病毒(OrfV)B2L基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答效果,本研究对pMD18T-B2L质粒进行PCR扩增,克隆B2L片段至pVAX1载体中构建pVAX1-B2L重组质粒,进行酶切和测序鉴定;采用脂质体法将pVAX1-B2L真核表达质粒转染MDBK细胞,RT-PCR和IFA法检测B2L基因在MDBK细胞中的转录和表达;将构建的DNA疫苗免疫KM系小鼠,采用间接ELISA、MTT和FACS法对其诱导的免疫应答进行研究。结果显示,成功构建pVAX1-B2L真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达;免疫小鼠后,DNA疫苗能诱导小鼠产生OrfV特异性抗体;脾淋巴细胞增殖、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子均高于pVAX1组和PBS组。结果表明,本研究制备的DNA疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答。 相似文献
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为探究表达鸭肠炎病毒(DEV)gB/NP28双基因重组减毒沙门菌口服疫苗在鸭体内诱导免疫应答能力,本研究将构建的重组菌(pcDNA3.1-DEV-gB/NP28)/SL7207、DVE弱毒疫苗、重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB/NP28及PBS分别免疫雏鸭,通过间接免疫荧光法检测免疫鸭脾脏、胸腺、法氏囊、哈德氏腺组织中的抗原表达;双抗体夹心ELISA方法检测肠道黏膜sIgA;间接ELISA方法监测血清中DEV特异性抗体、外周血T淋巴细胞增殖及IFN-γ、IL-4细胞因子含量,对该口服疫苗进行免疫学评价。结果表明,重组菌能够诱导鸭产生良好的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答;攻毒试验显示,在DVE强毒攻击下重组菌免疫可提供75%以上的保护,表明重组菌免疫对DEV攻击具有一定的免疫保护作用。 相似文献
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本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒（orf virus，ORFV）流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料，提取病料DNA，经PCR鉴定为ORFV阳性；将阳性病料做常规处理，接种羔羊睾丸细胞（LT），并盲传至5代，观察接毒LT细胞病变，将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID50测定。结果显示，经PCR检测，18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%（11/18）；大足株病料接种LT细胞36 h后，长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩，72 h后大部分细胞脱落；间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光，且荧光绕核分布；F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带，大小为1 137 bp；将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对，其核苷酸同源性在97.9%~100%之间，与美国SA00分离株同源性达100%，且遗传进化分析显示处于同一进化分支，亲缘关系较近；测定F5代细胞培养物TCID50值为10-5.68/0.1 mL，在细胞中能稳定增殖。综上所述，本研究成功分离并获得1株ORFV，为后续ORFV研究提供了生物材料，同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。 相似文献
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为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L融合基因在MDBK细胞中的表达;将pVAX1-B2L-F1L、pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1空载体、生理盐水对照组KM系小鼠通过后腿肌肉注射的方式免疫,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ)、Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-B2L-F1L重组质粒能够在MDBK细胞中表达;pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体及IL-2和IFN-γ水平均显著高于pVAX1-B2L-F1L组;该联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6细胞因子水平与pVAX1-B2L-F1L组相比差异不显著(p>0.05);该联合免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L-F1L组(p<0.05)。由此表明,pVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫应答,联合pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能够促进Th1型细胞因子的分泌。本研究为OrfV基因工程疫苗的研制提供了参考依据。 相似文献
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旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。 相似文献
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为了构建羊口疮病毒B2L和F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L,探讨制备安全可靠羊口疮病毒核酸双基因疫苗的可行性,试验通过Primer Premier 5.0软件设计B2L和F1L融合基因2对引物,应用SOE-PCR技术将B2L和F1L连接起来,用限制性内切酶消化后插入pVAX1真核表达载体中,构建B2L-F1L融合基因表达质粒,再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,对真核表达质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定及序列测定。结果表明:利用SOE-PCR技术成功扩增出B2L-F1L融合基因;对真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L进行PCR鉴定和双酶切鉴定后,均可得到与预期大小一致的DNA片段;测序发现,真核表达质粒目的基因序列与预期设计一致。说明真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L构建成功。 相似文献
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为建立鉴别鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的多重PCR检测方法,参考文献合成针对DPVUL6基因、GPVNS基因和MDPVVP1基因序列的特异性引物。通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。结果显示,该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性,表明特异性较强;DPV、GPV和MDPV的最低核酸检出量分别为237.3pg、22.45pg和204.6pg,表明敏感性良好;该方法对DPV+GPV+MDPV、DPV+GPV、DPV+MDPV、GPV+MDPV、DPV、GPV和MDPV的核酸均能扩增出与预期大小一致的目的条带,表明该多重PCR方法重复性较好。本研究方法具有特异性强、敏感性良好、重复性较好和快速简便等特点,可用于DPV、GPV和MDPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。 相似文献
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