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为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD融合蛋白的理论相对分子质量一致。经镍柱纯化后,重组蛋白的质量浓度为2.5 mg/m L,纯度约为95%,Western Blot及ELISA鉴定结果显示该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,可用于IBRV抗体检测试剂盒的开发。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。 相似文献
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猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)14 d后就可以产生针对非结构蛋白(Non-Structural Protein 7,Nsp7)的抗体,而且抗体水平很高,与N蛋白抗体水平相似,但比N蛋白抗体持续时间更长。另外,检测Nsp7抗体可用于区分PRRSVⅠ型和Ⅱ型的感染。本试验旨在建立一种快速、特异且敏感的检测血清中PRRSV抗体的方法。试验根据NCBI数据库录入的Nsp7蛋白序列(GenBank:EF536003)设计引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增Nsp7基因,构建原核表达载体pET28a-Nsp7,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,Western Blot鉴定表达产物。将纯化后的重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其条件进行优化,最终建立检测PRRSV Nsp7抗体的间接酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法。结果表明,试验表达了重组Nsp7蛋白,重组的Nsp7蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,建立了一种基于重组Nsp7蛋白的间接ELISA检测方法。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PRRSV抗体检测试剂盒检测结果相比,两者符合率为87.74%。试验表明,建立的间接ELISA方法可以用于PRRSV抗体的检测。 相似文献
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为了建立起双抗体夹心ELISA定量测核衣壳蛋白(caspid protein,Cap)抗原方法,采用氯化铯密度梯度超速离心方法制备猪圆环病毒2型Cap蛋白标准品,制备出针对PCV2-Cap单克隆抗体及PCV2-Cap多克隆抗体,筛选最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度,绘制标准曲线,验证方法,并应用该方法对不同转移载体构建的PCV2-Cap蛋白随时间变化的表达量进行测定。结果显示:最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度均为1∶10 000,标准曲线的范围是15.6~250 ng/m L,线性相关系数≥0.99,准确性为(103.46±12.50)%,特异性良好;检测不同转移载体构建的Cap表达量随时间的变化,发现Cap含量接种后24 h开始表达,72 h达到高峰,呈S形曲线增长模式。结果表明:已建立的双抗体夹心ELISA定量测Cap抗原方法灵敏度、精密性和准确性均符合研究要求。 相似文献
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