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为探究一株中度嗜盐菌-肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)NEAU-ST10-25T的耐盐碱机制,采用基因文库筛选方法从该菌株获得一个重组质粒p UC-LYS1。该质粒可恢复大肠杆菌(Escherichia coli)Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc在含有0.2 mol·L-1Na Cl的LBK培养基上生长。序列分析显示,重组质粒p UC-LYS1中外源DNA片段由1个N端截短的ORF1、三个完整的ORF(ORF2-4)以及1个C端截短的ORF5组成。其中,ORF4与伸长盐单胞菌(Halomonas enlongata)中1个推测的胞苷酸激酶(Cytidylate kinase,CMK)同源性最高(86%)。为便于区分与其同源物,编码ORF4的基因cmk来自肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)被定名为Hz_cmk。Hz_CMK也与包括已被鉴定来自大肠杆菌(E.coli)的Ec_CMK等其他同源物具有较高同源性。为进一步鉴定Hz_cmk是否编码胞苷酸激酶,通过PCR扩增分别将Hz_cmk和大肠杆菌(E.coli)的同源基因Ec_cmk(作为正对照)构建至原核表达载体p ET19,转化到大肠杆菌(E.coli)C41(DE3)感受态细胞中诱导表达。SDS-PAGE表明其以可溶形式存在。酶学分析表明Hz_CMK与Ec_CMK均具有较高胞苷酸激酶活性。为国内外首次中度嗜盐菌的胞苷酸激酶基因功能鉴定。 相似文献
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偶联钠离子转运草酰乙酸脱羧酶是第一个被发现具有初级钠离子泵活性脱羧酶家族成员,由α,β,γ三个亚基以及生物素组成。由于其脱羧反应对柠檬酸发酵途径具有关键作用,并且在脱羧过程中偶联钠离子输出,该酶已受到学术界广泛关注。目前,该酶已在包括克雷伯菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)和弧菌属(Vibrio)等多个属细菌中被发现,并且其生理学基本特征已被鉴定。在肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中,该酶中参与偶联脱羧反应钠离子输出重要氨基酸活性位点通过拓扑学分析、定点突变等方法被深入地进行鉴定,在此基础上能量偶联模型被提出以解释该酶偶联钠离子输出脱羧反应机制。本文对以上研究进展进行综述并对该酶未来研究方向加以展望。 相似文献
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大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。 相似文献
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为分析编码多亚基钠/氢逆向转运蛋白Group 2型mrp(mrp2)操纵子耐盐碱能力,首先构建mrp2自杀质粒p K18mobsac B-mrp2-Nco I,电转化野生型菌株-松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39T,基于以上基因敲除原理获得mrp2敲除菌株。PCR验证及测序结果表明,成功获得mrp2敲除菌株,并将其命名为NEAU-ST10-39T-△mrp2。为进一步验证突变株正确性,构建重组穿梭载体p BBR1-MCS5-mrp2,转化敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2,获得转化子命名为NEAU-ST10-39T-△mrp2/p BBR1-MCS5-mrp2。耐盐碱测试显示,NEAU-ST10-39T-△mrp2/p BBR1-MCS5-mrp2表现出与野生型菌株类似耐盐碱能力,进一步证实敲除菌株NEAUST10-39T-△mrp2构建正确;随Na Cl浓度和p H升高,敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生长受到抑制,表明mrp2对宿主菌NEAU-ST10-39T在高盐碱条件下生长具有重要作用。电转化方法可避免p K18mobsac B在三亲本接合过程中受体菌抗性筛选、突变株纯化弊端,简化质粒导入宿主程序;NEAU-ST10-39T-△mrp2成功构建为敲除盐单胞菌中其他耐盐碱基因和揭示该基因耐盐碱机制奠定基础。 相似文献
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以E. coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除：大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除；大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉素抗性筛选和蔗糖反向筛选被无痕敲除；大肠杆菌中主要负责诺氟沙星外排的MFS超家族转运蛋白mdtH基因通过与pK18mobSacB质粒中的抗性片段的同源重组被敲除。以上基因敲除不同程度导致大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性变化，最终获得诺氟沙星敏感性为0.0125μg·mL-1的E. coli KYAH06，为大肠杆菌MdtH详细转运机制以及其他诺氟沙星外排转运蛋白鉴定和功能分析奠定试验基础。 相似文献
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