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提高PCR产物T-A克隆效率的研究 总被引:6,自引:0,他引:6
摘要:比较了3种T-A克隆法对于4个不同长度PCR产物的克隆效率。结果表明,对于较短的PCR产物(500 bp左右),采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率;对于中等长度的PCR产物(3 000 bp左右),用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率;对于较长的PCR产物(6 000 bp左右),用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率。 相似文献
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摘要:利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18(GenBank登录号:AF129872)的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框(open reading frame, ORF)长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21(DE3)中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。 相似文献
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利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
摘要: 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只(其中2只死胎),Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝(公)和9拷贝(母)。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列(MARs)的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。 相似文献
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用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5) 相似文献
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人肥胖基因(Obese)转基因小鼠动物模型的建立 总被引:7,自引:1,他引:6
用三个含有兔乳清酸性蛋白基因(rWAP)启动子,人ob基因(cDNA)及rWAP基因终止子的质粒经亚克隆构建了融合表达载体.用NotI消化表达载体,回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5 kb)并进行显微注射.注射用的DNA浓度为2 g/mL,每mL注射液中DNA的拷贝数约为2.4??011 ,每一枚原核期小鼠胚胎注射1~2 pL.采用标准的显微注射方法,获得48只后代小鼠.四周龄时剪尾并提取尾组织DNA,以人ob基因cDNA为探针,用EcoRI消化总组织DNA,经Southern杂交确证其中两只母鼠为转人ob基因小鼠.在出生的后代小鼠中,转基因阳性率约为4 %(2/48). 相似文献
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抗精子sp18单克隆抗体对小鼠体外受精胚胎发育的抑制作用 总被引:1,自引:1,他引:0
哺乳类受精时,精子的多种膜蛋白、顶体蛋白和胞质蛋白参与了受精过程,因此,研究人员的目光都集中在这些功能蛋白在睾丸中的生成、附睾中的水解和扩散、顶体反应中的作用和扩散以及它们在受精过程中的主要功能等。然而,对于精子蛋白在受精后的命运这个基本问题的研究,几乎是个空白领域。可以肯定的是,精子的顶体区膜蛋白和顶体蛋白在受精过程中被释放;胞质蛋白和顶体内膜蛋白通过胞吞作用进入卵子内部,其中,胞质中的钙振荡蛋白可以激活卵子,是新生命的发动者;顶体后区和尾部膜蛋白伴随着受精过程掺入卵子质膜,演化成受精卵的质膜蛋白,对于这类蛋白的最终结局和潜在的功能,我们的认识还很有限,英国生物学家发现,大鼠精子尾部的2D6膜蛋白(23 kD)掺入受精卵质膜后,随着胚胎发育过程而逐渐弱化,至2-细胞期时,胚胎表面的2D6完全消失,因此无法研究该抗原在胚胎发育中是否具有生理功能,这方面的研究工作处于停滞状态。 相似文献
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季节对超数排卵兔卵母细胞数量及质量的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
用孕马血清促性腺激素PMSG配合人绒毛膜促性腺激素hCG处理中国白兔,对4个季节超排兔卵母细胞的数量和孤雌胚胎以及卵胞浆内精子注射(ICSI)胚的体外发育能力进行了评定.结果表明.春季成熟卵母细胞的获得数量显著高于冬季(P0.05),而其他季节之间差异不显著(P0.05);两种卵子(孤雌激活和ICSI)的卵裂率不受季节影响(P0.05),但夏季两种胚胎的囊胚形成能力显著低于其他3个季节(P0.05).所以,季节既影响超数排卵兔的卵母细胞数.也影响卵母细胞的质量. 相似文献