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草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒是当前引起我国草鱼出血病的主要流行毒株,VP56是其外层衣壳上的唯一突起蛋白并有可能在病毒入侵阶段发挥核心作用,但该蛋白的具体功能尚不清楚。为了探讨VP56的生物学功能,分别利用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统研究了VP56的体外表达特性。首先从GCRVJX02W株的细胞感染混合物中抽提总RNA,并通过RT-PCR方法获得目的基因VP56,分别克隆至pGEX-4T-3及pFastBacHTA载体上,将质粒pGEX-4T-3-VP56转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后,成功表达融合蛋白GST-VP56,大小为83ku,以包涵体形式存在;蛋白经纯化后免疫老鼠,制备了VP56的多克隆抗体,可以和rVP56产生特异性免疫结合。将pFastBacHTA-VP56转化至DH10Bac,成功转座后,提取重组杆粒DNA并鉴定且测序正确后转染SF9昆虫细胞。结果表明,自转染96h起,转染杆粒的细胞生长停滞,不断裂解。Westernblot结果显示,细胞表达重组蛋白His-VP56,大小约为62ku,为可溶蛋白。本研究利用原核表达系统和真核表达系统体外表达了VP56蛋白,制备了抗VP56多克隆抗体,为深入研究VP56蛋白在病毒入侵时的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。 相似文献
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【目的】研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代学、药效动力学联合参数,确定盐酸沙拉沙星治疗鲫鱼细菌性疾病的防耐药突变用药方案。【方法】测定盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的体外最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、抗菌后效应(PAE)、防耐药突变浓度(MPC)和防耐药突变选择窗(MSW);给鲫经口灌服不同剂量(20,30,40mg/kg)的盐酸沙拉沙星,于给药后0.5,1,2,4,6,8,10,12,16,24,48h取血清及肌肉样品,研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代动力学,然后结合药代动力学和药效动力学结果,确定盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的合理给药方案。【结果】盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的MIC为0.5μg/mL,MBC为2.0μg/mL,MPC为2.5μg/mL,MSW为0.5~2.5μg/mL。按20,30,40mg/kg剂量给鲫鱼经口灌服盐酸沙拉沙星后,鲫鱼体内的血药质量浓度大于MPC的维持时间分别为0,4.0,24.0h;AUC24/MIC分别为8.44,78.20,164.96;Cmax/MIC分别为4.496,6.662,15.294。【结论】40 mg/kg灌服剂量能使鲫的血药浓度维持在MPC以上的时间≥(24-PAE)h、AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC8,因此建议盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的防突变用药方案为:给药剂量40mg/kg,每日给药1次,休药期不低于10d。 相似文献
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为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A(Gc JAM-A)基因,并构建p GADT7-Gc JAM-A载体,在酵母中研究草鱼Gc JAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒p GBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与Gc JAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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