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利用自动发酵罐培养毕赤酵母,甲醇诱导其分泌表达重组猪IFN-α(r Po IFN-α);经硫酸铵沉淀、G-25琼脂糖柱脱盐处理及阴离子交换柱和分子筛层析纯化。以纯化r Po IFN-α蛋白作为抗原免疫6周龄BALB/c鼠3次后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选和3~5次亚克隆,共获得5株均能稳定分泌抗r Po IFN-α单克隆抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚类鉴定、特异性和叠加试验结果表明,这5株抗体均属于Ig G1亚类,能与r Po IFN-α产生特异性反应,其抗原结合位点相同或相近。该研究有助于进一步推动r Po IFN-α单克隆抗体在猪免疫学以及猪疫病诊断中的应用。 相似文献
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采用斑点胶体金技术建立一种快速、简便、准确检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法。运用RT-PCR技术克隆出PRRSV核衣壳蛋白基因,经原核表达与蛋白纯化获得重组的核衣壳蛋白,作为诊断抗原。采用柠檬酸三钠还原法制备了直径为18~20 nm的胶体金,对兔抗猪IgG抗体进行标记后,进一步组装成斑点胶体金免疫检测试剂。经猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阴性和阳性血清检测,斑点胶体金免疫检测试剂仅与阳性血清发生反应,特异性强,反应30~40 min内就可以在硝酸纤维膜上出现清晰的红色斑点,其灵敏度和Dot-ELISA法相仿。该检测方法可广泛应用于PRRS的临床诊断和流行病学调查,也可作为研究兽医快速诊断的技术基础。 相似文献
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为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本184份,总阳性率为68.5%。 相似文献
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为原核表达副猪嗜血杆菌(H.parasuis)CDT毒素并检测其在体外培养时的分泌表达情况,本实验将切除信号肽的CDT毒素的3个亚基基因分别克隆于pET-28a载体中在大肠杆菌进行表达,并将重组蛋白经亲和层析纯化后,免疫兔制备抗血清,用于鉴定H.parasuis体外培养时CDT分泌表达情况。结果表明CDT毒素3个亚基均在Rosetta菌株中得到表达,其中cdtB约为28.2 ku,符合预期大小,而cdtA和cdtC亚基比预期的23.5 ku和17.4 ku略大。表达的3个重组蛋白可以被自然感染猪血清识别,表明其具有良好的反应原性,同时也表明H.parasuis在猪体内定殖或感染过程中分泌CDT。制备的抗血清可以与体外培养H.parasuis的分泌蛋白中的CDT亚基反应,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,同时也表明H.parasuis体外培养时也分泌CDT。 相似文献
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猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
利用PCR方法扩增获得EMCV非结构蛋白3AB基因,并将其克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacm id-3AB,经脂质体介导转染sf9细胞获得重组杆状病毒,并IFA和W estern b lotting鉴定其抗原性。结果表明,EMCV 3AB基因在昆虫细胞中获得成功表达,分子量约16 ku,具有良好的EMCV抗原性。因此利用杆状病毒表达系统成功表达了EMCV 3AB基因,为该病毒抗原表位和诊断方法研究奠定了重要基础。 相似文献
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为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP2)之间的差异和生物学特性,本研究根据PRRSV、S1、SY0608株NSP2基因序列保守区设计引物,通过RT-PCR扩增出两毒株的NSP2基因,克隆到pFastBacTM HTB杆状病毒载体中,将筛选的阳性重组载体pF-SI-NSP2和pF-SY-NSP2,分别转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBac-S1-NSP2和rBac-SY-NSP2.在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc-S1-NSP2和rAe-SY-NSP2,Westernblot和间接免疫荧光实验结果表明,本研究成功构建了表达PRRSV S1和SY0608株NSP2蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白与自然感染PRRSV的猪血清均具有良好的反应原性,为进一步研究NSP2蛋白的功能及生物学和免疫学特性奠定了基础. 相似文献
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副猪嗜血杆菌重组P2蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
根据GenBank中副猪嗜血杆菌(HPS)的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了1 077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为60 500的可溶性融合蛋白P2-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的30%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达92.5%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法(P2-ELISA),并用所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为93.4%。结果表明,本试验建立的P2-ELISA与Synbiocits-ELISA具有同样高的特异性。 相似文献