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[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础. 相似文献
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[目的]构建鼠源抗HepG2核糖体展示抗体库。[方法]以培养的HepG2肝癌细胞4次免疫Balb／c小鼠,取脾脏分离总RNA,逆转录合成第一条链,PCR扩增重链可变区和轻链k,经linkerDNA连接形成VH／k核糖体展示抗体库。将VH／k与pMD18-T载体的连接产物转化E．coliTGI,蓝白斑筛选,挑取白色菌落,提取质粒,PCR鉴定,并测序。[结果]VH和k链得到正确的扩增,长度分别为399和6476p,VH／k连接产物正确,连接产物长度为10936p：[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗Hepc2核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗HepG2特异性单链抗体奠定基础。 相似文献
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[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker（VH—linker）序列,以及轻链可变区和Linker（VK—linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH／K与pMD19一T载体链接产物转化E．coliDH50L,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689bp,V14／κ连接产物正确,连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗IcosL特异性单链抗体奠定基础。 相似文献
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构建重组人ICOS胞外区原核表达载体,并进行初步表达.根据GenBank基因库中ICOS胞外区基因序列设计引物,用RT-PCR法从人T淋巴瘤细胞Jurkat的总mRNA中扩增出ICOS胞外区基因并运用重叠延伸PCR技术扩增出ICOS胞外区同源二聚体,并将ICOS胞外区同源二聚体插入到原核表达载体PET-28a中,并对重组质粒进行鉴定.转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白.结果获得ICOS胞外区同源二聚体基因大小为757bp,构建的重组表达载体中目的基因序列完全正确.IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约为31ku.这说明成功地构建人重组ICOS胞外区同源二聚体的原核表达载体,并实现在大肠杆菌中大量表达.为下一步蛋白纯化及制备抗ICOS单克隆抗体奠定了基础. 相似文献
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