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背景 随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维（porcine Fetal Fibroblasts,PFFs）细胞的转染效率有关。目的 研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM ?830/NEPA 21/Nucleofector TM2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。方法 使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10 6个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。结果 首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector TM 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12 μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM ?830和Nucleofector TM 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12 μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%（电转参数：脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3 次）和14.63%±3.21%(电转参数：U-023),而NEPA 21使用10 μg质粒转染PFFs时效率达到最高（6.09%±0.72%）。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。结论 因此Nucleofector TM 2b转染PFFs的最佳条件为：U-023程序、12 μg超螺旋质粒;NEPA 21为：脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10 μg超螺旋质粒;ECM ?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3 次条件下转染12 μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector TM 2b。 相似文献
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目的 在哺乳动物细胞中,RAD51和RAD18是调节同源定向修复和非同源末端连接的关键因子。本研究目的在于探讨这2个因子在eSpCas9系统中对HEK293T细胞的定点敲入(Knock-in, KI)效率的影响,进而提高KI效率。方法 通过构建eSpCas9-RAD51、eSpCas9-RAD18融合蛋白以及过表达RAD51、RAD18载体,比较它们的KI效率差异。结果 eSpCas9-RAD18系统可以显著提高HEK293T细胞KI效率,约为原来eSpCas9系统的1.4~1.9倍(P<0.01),而eSpCas9-RAD51系统和过表达RAD51/RAD18对KI效率无显著提高作用。结论 本研究构建的eSpCas9-RAD18系统可以有效地提高HEK293T细胞的KI效率,可为基因编辑、基因治疗及定点转基因提供一种新的辅助整合工具。 相似文献
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