利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定          下载免费PDF全文

郝振凯  汤新明  张媛媛  谢福杰  陈君敏  索静霞  索勋  刘贤勇 《中国农业大学学报》2023,28(8):183-190

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法，本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析，基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点，通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数，最后利用PCR扩增验证分析位点。结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb，Q20为96.1%，Q30为89.2%，能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361×2，平均测序深度为80×，reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀，测序的随机性比较好，可以进行后续分析；2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3 036，平均测序深度为140×，嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点，位于HG994969.1:2 704 213~2 705 255；3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×，T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85×，而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5′调控区序列的平均测序深度为154×，Actin基因的3′调控区序列的平均测序深度为164×，同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍，这表明T-DNA为单拷贝，与发现一个插入位点的结果相符合；4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点。转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台，也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点。  相似文献