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IFN-α是干扰素的一种,其对动物免疫力和抗病能力的增强有重要的作用,本试验首次通过PCR技术克隆鸡十二指肠和法氏囊IFN-α基因,并使用生物信息学的方法分析IFN-α基因和蛋白的理化性质和结构.结果显示,鸡十二指肠、法氏囊都有IFN-α基因的表达,其是一种主要由α螺旋排列而成的蛋白质. 相似文献
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为研究小鼠Oct-1基因的生物学特性,试验扩增小鼠黑色素细胞中Oct-1基因CDS区序列,并运用生物信息学软件分析小鼠Oct-1基因序列的特性、编码蛋白理化性质、亚细胞定位、靶基因及保守性结构域等,从而预测其是否调控黑色素的生成。结果表明,小鼠Oct-1基因大小为2 313 bp,编码蛋白质的分子式C3425H5606N976O1163S15,是一个不稳定可溶性蛋白质,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,亚细胞定位主要分布在细胞核,推测其可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用;Oct-1基因在小鼠黑色素细胞中表达,其编码的蛋白含有一个保守的POU结构域和一个保守的同源域,参与调控13个黑色素形成相关基因转录表达,在黑色素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的启动子上存在Oct-1转录因子的作用位点,Oct-1蛋白质还可能与Brf2、Pou2af1、Tbp等蛋白相互作用调控毛色基因表达,故可以推测转录因子Oct-1在黑素细胞的黑色素生成中发挥着重要的作用,为研究毛色形成机制提理论依据。 相似文献
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【目的】高度保守的PAX转录因子家族在黑色素细胞的分化和黑色素的生成中起重要的作用,其家族共有的PD结构域是其与下游基因结合的主要位点,而PD结构域氨基端的PAI亚结构域在其与下游基因的结合过程中发挥重要的作用。研究表明Pax6在视网膜上皮黑色素细胞的分化中发挥至关重要的作用,本试验借助研究Pax6 PAI亚结构域的功能来对PAX转录因子家族共有的PD结构域和PAI亚结构域进行研究。【方法】首先通过Psipred对Pax6 PD结构域的结构进行分析,使用NCBI对Pax6 PD结构域与下游基因的结合位点进行分析,使用Jaspar对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2启动子中Pax6 PD结构域可能的作用位点进行预测。使用普通PCR克隆Pax6PAI亚结构域,将其连入T载体,酶切后连入慢病毒载体,并送公司测序确认。将构建好的PAI亚结构域过表达载体通过细胞转染导入到培养的小鼠黑色素细胞中,使其过量表达。收集细胞,分别通过观察绿色荧光蛋白检测转染效率,使用RT-PCR和Western blot来检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2在m RNA和蛋白水平的变化,同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】通过NCBI分析可知,Pax6 PD结构域与下游基因的作用位点主要集中在氨基端的PAI亚结构域。通过Jaspar预测分析,得知,MITF启动子-695处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYR启动子-873和-1133处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYRP1启动子-629处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYRP2启动子-655处存在Pax6 PD结构域的结合位点。在黑色素细胞中过表达Pax6 PAI亚结构域后,与空载组相比,试验组MITF m RNA升高2.05倍(P0.01),蛋白质升高1.7倍(P0.01);TYR m RNA升高2.09倍,蛋白质升高2倍(P0.05);TYRP1 m RNA升高2.93倍(P0.05),蛋白质升高1.9倍(P0.01);TYRP2 m RNA升高3.62倍(P0.01),蛋白质升高1.37倍。同时试验组的黑色素含量是空载组黑色素含量的1.33倍(P0.001)。【结论】在小鼠黑色素细胞中,过表达Pax6 PAI亚结构域可以促进MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,进而使黑色素细胞黑色素的生成量增加。 相似文献
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【目的】MITF和β-catenin是黑色素生成通路中重要的调节基因,而Pax6通过调控MITF和β-catenin来调控黑色素细胞的黑色素生成,通过对只含有正常Pax6 paird domain的前102个氨基酸的Pax6~(10Neu)的研究,来探究Pax6~(10Neu)是否还有生物学功能,以及Pax6对其下游基因的作用机理。【方法】根据NCBI查找到的Pax6~(10Neu)基因序列设计PCR引物,克隆Pax6~(10Neu),收集所得基因片段送华大基因测序确认。后通过对Pax6~(10Neu)和慢病毒表达载体的序列分析来筛选合适的酶切位点,通过分析选取Sal I和Xba I作为酶切位点,设计含有Sal I和Xba I酶切位点的PCR引物,大量克隆Pax6~(10Neu)基因,从而通过胶回收得到含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6~(10Neu)基因。将含有酶切位点的目的片段与T载体相连,并送华大基因测序。将与T载体连接成功的质粒导入感受态细胞使其大量扩增,提取质粒,双酶切后,胶回收,得到大量含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6~(10Neu)基因片段,将其与含有小鼠tyrp2特异性启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因测序确认。将连接好的慢病毒表达载体导入感受态细胞使其大量扩增,通过质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的Pax6~(10Neu)慢病毒真核表达载体。将慢病毒真核表达载体通过细胞转染导入到培养的绵羊黑色素细胞中,使其过量表达。收集细胞,分别通过观察绿色荧光蛋白和使用RT-PCR来检测转染效率,使用RT-PCR和Western blot来检测MITF和TYR在m RNA和蛋白水平的变化,同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】与正常组相比,在m RNA水平,MITF显著升高3.2倍(P0.05),TYR升高1.31倍,由此得出,Pax6~(10Neu)可以有效促进MITF m RNA的产生,对TYR m RNA产生的影响不是太显著;在蛋白质水平,MITF显著升高8.24倍(P0.001),TYR显著升高2.09倍(P0.001),由此得出,Pax6~(10Neu)可以显著提高MITF、TYR蛋白的产生;同时黑色素细胞产生黑色素的量显著升高1.22倍(P0.05),由此得出Pax6~(10Neu)可以有效促进黑色素细胞黑色素的生成。【结论】只含有正常Pax6 paird domain前102个氨基酸的Pax6~(10Neu),仍然可以在黑色素细胞中与MITF相互作用,同时间接调控TYR的表达,从而使黑色素细胞黑色素的生成量发生改变。 相似文献
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