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由大麦坚黑粉菌(Ustilgo hordei)引起的坚黑穗病广泛分布于我国青稞主产区,病原侵染后形成病穗从而造成产量损失。基于前期初步建立的青稞黑穗病快速检测体系,通过对种子洗涤沉淀物的总基因组DNA进行提取,并进行环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测人工模拟及实际种子带菌情况,以期建立完善的青稞坚黑穗病快速检测技术。结果表明,裂解液快速提取法可以对样品总DNA进行有效提取,完善后的LAMP快速检测技术可以有效开展青稞种子携带大麦坚黑粉菌的检测。 相似文献
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【目的】大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)和裸黑粉菌(Ustilago nuda)是引起青藏高原青稞黑穗病的主要病原菌,建立快速、简便、特异性强的大麦坚黑粉菌和裸黑粉菌环介导等温扩增技术(LAMP)检测体系,检测青稞种子的带菌量,再依据带菌程度进行播前种子处理,是控制青稞黑穗病的重要技术手段。【方法】根据大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)和裸黑粉菌(Ustilago nuda)的ITS基因序列与其他对照菌株同源性低的区段设计并获得有效引物1组,建立LAMP检测体系,并选取影响LAMP反应体系的5个主要因素dNTPs、甜菜碱、镁离子、Bst DNA聚合酶及温度进行单因素试验对其进行优化,最后对优化后的LAMP检测体系进行灵敏度和特异性检测。【结果】建立了青稞黑穗病菌的LAMP检测体系,其优化后dNTPs浓度为1.8 mmol/L、甜菜碱浓度为0.8 mmol/L、镁离子浓度为10 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为320 U/mL,反应温度为65℃。应用该体系在45 min内能检测出2×10~(-4)ng/μL的裸黑粉菌,在60 min内能检测出2×10~(-4) ng/μL的大麦坚黑粉菌,即在60 min内可检测出2×10~(-4)ng/μL的大麦坚黑粉菌和裸黑粉菌。建立的青稞黑穗病菌LAMP检测体系对大麦坚黑粉菌和祼黑粉菌具有特异性。【结论】建立了青稞黑穗病菌的LAMP检测体系,该体系能在1 h内检测出2×10~(-4)ng/μL的裸黑粉菌和大麦坚黑粉菌。 相似文献
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【目的】建立青稞条纹病的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测体系,为青稞种子带菌检测及其条纹病的有效防控提供参考。【方法】根据麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）的ITS-rDNA序列区间设计5组引物,从中筛选特异性引物,并通过设置60,61,62,63,64和65 ℃ 6个温度梯度来优化LAMP反应体系的温度,以建立高效检测麦类核腔菌的LAMP技术体系;分别以麦类核腔菌、大麦坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、细链格孢和禾谷镰孢菌基因组DNA为模板进行LAMP扩增反应,对该体系的特异性进行检测;以310,31,3.1,0.31,0.031和0.003 1 pg/μL的麦类核腔菌基因组DNA为模板,对该体系的灵敏度进行分析;最后利用该体系对肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15 等5个青稞主栽品种的种子带菌率进行检测。【结果】青稞条纹病LAMP检测体系的特异性引物为引物组2,最佳反应温度63 ℃,反应时间70 min;该检测体系对麦类核腔菌具有良好的特异性,其最低检测限为0.31 pg/μL;肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15种子的带菌率分别为68.18%,72.73%,100%,77.27%和68.18%。【结论】建立了青稞条纹病LAMP检测体系,该体系能在63 ℃、70 min内检测出青稞种子是否携带条纹病菌。 相似文献
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