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【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID_(50)为5×10~2 mL~(-1)。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。 相似文献
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为了研究猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白(M蛋白)亲和肽的病毒亲和性,建立快速有效的TGEV检测方法,设计了1条含有TGEV M蛋白亲和肽的串联基因,核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工基因合成获得了含有M蛋白亲和肽基因的重组质粒pUC57-MQHT。然后,根据合成基因的序列,设计合成了1条特异性引物,以pUC57-MQHT为模板,通过PCR获得了150 bp的TGEV M蛋白亲和肽基因。亲和肽基因通过BamHⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1,获得重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。重组质粒经BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT,分子质量分别为25,31 ku。切胶纯化后,重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT分别经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。Western Blot分析表明,2种重组蛋白可与TGEV特异性结合。Dot-ELISA分析表明,在TGEV滴度为1×10~3,5×10~2,2.5×10~2 TCID50/mL时2种重组蛋白都可显示出阳性反应,而在1.25×10~2 TCID50/mL滴度时无可见斑点,具有良好的TGEV亲和性。阻断试验表明,1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株(1×10~5 TCID50/mL)与2种重组蛋白的结合,特异性良好。为建立TGEV诊断方法奠定了一定的理论和物质基础。 相似文献
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