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胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)广泛存在于昆虫体内,可抑制胰蛋白酶的水解活性。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白酶活性染色的方法,研究不同家蚕品系的丝腺、同一品系家蚕的不同组织器官及不同发育时期丝腺中胰蛋白酶抑制剂种类和活性的多态性,以丰富家蚕丝蛋白的合成、分泌及保护机制研究的基础信息。在22个家蚕品系上蔟第2天的蚕体丝腺中,共检测到6种胰蛋白酶抑制剂,分别命名为TI-Ⅰ~TI-Ⅵ,其中大部分家蚕品系都有TI-Ⅵ,有TI-Ⅳ的品系也较多,而有TI-Ⅱ的品系最少,家蚕不同品系间TI的种类分布不一致;在幼虫5龄期,TI活性随着丝腺的发育逐渐增强;在家蚕品系大造上蔟第1天蚕体的7个组织器官中,只在血液、精巢和丝腺中检测到TI,其中血液和丝腺中各检测到2种TI,精巢中检测到1种TI,而且同一家蚕品系含有TI的组织器官中的TI种类也不一致。对茧丝中3种TI(TI-Ⅲ、TI-Ⅳ和TI-Ⅵ)的理化性质进行检测,发现不同种类TI对温度及p H的适应范围不同,其中TI-Ⅵ的适应范围较广。研究结果显示:不同家蚕品系丝腺中含有的TI种类以及6种TI活性的强弱表现出多态性;同一家蚕品系不同组织器官中的TI种类也具有多态性;温度和p H对不同TI的活性影响程度不同。 相似文献
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【目的】探讨家蚕（Bombyx mori）蚕丝纤维脱胶后蛋白质成分的变化,为了解丝蛋白在蚕丝纤维中的分布特征打下基础,并为改进蚕丝纤维加工工艺提供依据。【方法】利用木瓜蛋白酶、碳酸钠、尿素、中性皂和碱水法5种方法对蚕茧进行脱胶处理;并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同方法处理的蚕丝和不同蚕丝加工产品的脱胶程度,以及脱胶对丝素的影响;利用FASP酶解法和液相色谱-串联质谱联用的技术鉴定不同方法脱胶后的蚕丝及各种蚕丝加工产品的蛋白组分;利用生物信息学的方法对鉴定到的丝蛋白进行注释并通过非标定量的方法比较各种样品中丝蛋白的丰度。【结果】通过5种方法对蚕茧丝进行脱胶,蛋白电泳检测发现木瓜蛋白酶法降解丝胶蛋白的同时基本不会破坏丝素蛋白;碳酸钠法对丝胶的降解能力较弱,但对丝素的降解较强;中性皂法和尿素法对丝胶蛋白和丝素蛋白的降解都比较严重;碱水法的效果不理想。通过蛋白质组学研究发现木瓜蛋白酶和中性皂法脱胶后的蚕丝中几乎没有丝胶蛋白,主要是丝素蛋白、seroin 1和甘氨酸富含蛋白等;尿素法和碳酸钠法脱胶后的蚕丝中残留蛋白最少,主要是丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白等。通过蛋白电泳检测了6种蚕丝加工产品中的蛋白质,发现生丝和胚绸中的丝素蛋白比较完整,绸、缎和电力纺中的丝素蛋白出现了部分程度的降解,而丝绸旧衣中的丝素蛋白有严重的降解。通过蛋白质组学分析发现生丝和胚绸中的主要成分包括3种丝素、丝胶1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制剂SPI51等;绸、缎和电力纺的主要成分包括3种丝素蛋白和seroin 1,而丝绸旧衣中的主要成分包括3种丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白。【结论】木瓜蛋白酶脱胶法能够最大程度地保持丝素纤维的完整性,碳酸钠和尿素法的脱胶程度最高。生丝和胚绸中的丝胶蛋白含量很高,丝素纤维比较完整。绸、缎和电力纺中的丝胶蛋白很少,丝素纤维有部分程度的降解。蚕丝经过彻底的脱胶后还剩余的蛋白包括丝素重链、丝素轻链、丝素p25、seroin 1和甘氨酸富含蛋白。 相似文献
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丝氨酸蛋白酶在昆虫的新陈代谢和生长发育等多种生理过程中起重要作用,特别是含clip结构域的丝氨酸蛋白酶与昆虫的免疫级联激活途径密切相关。为探索家蚕clip丝氨酸蛋白酶在家蚕先天免疫反应信号通路中的作用,对家蚕(Bombyxmori)与烟草天蛾(Manduca sexta)中鉴定获得的含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶进行序列比对和系统进化分析,发现BmSP78与MsPAP-1、BmSP127与MsHP8、BmSP124与MsHP1、BmSP125与MsHP17位于同一进化支上,4对clip丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列相似度分别为70%、68%、81%和57%,另外的8个蛋白酶BmSP23、BmSP111、BmSP95、BmSP135、BmSP129、BmSP137、BmSP91和BmSP99构成了家蚕特有的一群clip丝氨酸蛋白酶。用革兰阴性细菌沙雷氏菌和革兰阳性细菌黑胸败血菌分别注射感染家蚕5龄第4天幼虫后,通过半定量RT-PCR检测分析clip丝氨酸蛋白酶基因在不同感染时间点的表达特征:病原菌诱导后蚕体中有11个clip丝氨酸蛋白酶基因mRNA转录水平有明显变化,其中BmSP102和BmSP96于黑胸败血菌诱导12 h后在血细胞中明显上调表达,而BmSP125在沙雷氏菌和黑胸败血菌感染12 h后的脂肪体中均明显上调表达。研究结果为建立家蚕clip丝氨酸蛋白酶可能参与的免疫级联反应路径提供了重要线索。 相似文献
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【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。 相似文献
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【目的】探讨家蚕(Bombyx mori)表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及与几丁质的结合方式,为家蚕表皮蛋白的功能研究提供依据。【方法】应用生物信息学方法分析家蚕CPAP家族表皮蛋白及BmCPAP3-G的结构域的序列特征;利用原核表达的方法表达BmCPAP3-G的融合蛋白,通过镍柱亲和层析技术纯化可溶性蛋白,利用5800 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定正确后进行多克隆抗体制备,并利用几丁质亲和层析技术验证BmCPAP3-G与几丁质的结合;利用半定量RT-PCR和Western blot方法对BmCPAP3-G的组织和时期表达情况进行检测;利用几丁质亲和层析技术探讨体外BmCPAP3-G的结构域与几丁质结合能力强弱的关系。【结果】BmCPAP3-G蛋白具有18个氨基酸组成的信号肽,分子量为27 k D,等电点为4.82,位于第15号染色体上,由3个相同的Cht BD2结构域组成,并且其结构域中的半胱氨酸和芳香族氨基酸的同源性较高;对BmCPAP3-G进行了克隆和原核表达,并利用镍柱亲和层析技术纯化到了较纯的可溶性蛋白,经5800 MALDI-TOF/TOF鉴定正确后制备了其多克隆抗体,通过几丁质亲和层析技术验证了BmCPAP3-G能够与几丁质进行结合;利用半定量RT-PCR和Western blot的方法对BmCPAP3-G的组织和时期表达情况进行检测,发现转录水平和蛋白水平的结果一致,BmCPAP3-G在头和表皮中的表达量较高,在中肠、生殖腺和丝腺中的表达量较低,从表皮和丝腺的时期表达情况分析BmCPAP3-G在4龄眠期的表达量最高,随着5龄期的进行表达量呈逐渐下降的趋势;为了探讨BmCPAP3-G结构域与几丁质结合的关系,对该蛋白的结构域进行原核表达及镍柱亲和层析纯化,成功纯化了有活性的结构域3、结构域1-2、结构域2-3,将这3个结构域进行几丁质亲和层析验证其与几丁质的结合能力,发现它们均能够与几丁质进行结合,但是结合能力有差异,结构域3相比于结构域1-2和结构域2-3的结合能力要弱,即两个结构域比单个结构域与几丁质的结合能力强。【结论】BmCPAP3-G为典型的CPAP家族的表皮蛋白,可能参与几丁质层在眠期的降解再形成过程。BmCPAP3-G单个Cht BD2结构域就能够与几丁质结合,但多个结构域的同时存在加强了其与几丁质的结合能力。 相似文献
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家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。 相似文献
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