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【目的】建立和优化苦荞愈伤组织遗传转化体系,为苦荞基因功能验证及分子育种提供研究工具。【方法】以苦荞品种“西荞二号”为材料,对苦荞愈伤遗传转化条件进行优化,包括苦荞外植体类型、诱导愈伤的激素比例、继代培养基的激素比例及农杆菌类型。利用苦荞类黄酮生物合成关键酶基因FtCHS1的过表达验证优化后的遗传转化体系。通过PCR筛选和荧光观察鉴定阳性株系,采用紫外分光光度法和高效液相色谱法（high performance liquid,HPLC）测定花青素及黄酮醇支路代谢物含量,使用实时荧光定量PCR分析类黄酮合成相关基因的表达,比较FtCHS1过表达愈伤组织与对照组的差异。【结果】苦荞诱导愈伤组织的最佳外植体为下胚轴,其最适诱导培养基为MS+0.8 mg·L-1 6-BA+3.5 mg·L-1 2,4-D,诱导率达72%;最优继代培养基为MS+3 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 KT,愈伤组织增殖率与增殖系数分别为98%和1.09;转化过程中的最佳农杆菌是GV3101,转化效率达31.3%;FtCHS1过表达愈伤组织中,花青素、芦丁和杨梅素的含量显著高于对照（P<0.05）,山奈酚和槲皮素的含量极显著高于对照组（P<0.01）;外源FtCHS1的过表达对转基因愈伤组织中5个内源同源基因FtCHSs的表达水平没有影响（P>0.05）,而FtCHI、FtF3H、FtFLS1、FtFLS2、FtFLS3和FtDFR1等黄酮合成途径关键酶基因均上调表达（P<0.05）。此外,特异性正调控黄酮醇合成的转录因子基因FtMYB5和FtMYB6上调表达,而花青素合成抑制子基因FtMYB8的表达降低（P<0.05）。【结论】建立了苦荞愈伤组织遗传转化体系,过表达FtCHS1的苦荞愈伤组织通过上调黄酮合成相关基因的表达增加类黄酮物质的积累。 相似文献
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【目的】克隆苦荞FtMYC基因,分析非生物胁迫对FtMYC基因表达及花青素含量的影响。【方法】根据苦荞转录组数据克隆FtMYC基因,对其进行生物信息学分析;通过4℃和UV-B胁迫处理芽期苦荞,分析胁迫后苦荞胚轴和子叶中FtMYC基因表达量与花青素积累之间的相关性。【结果】苦荞FtMYC基因DNA全长1 309 bp,由1个外显子和1个内含子构成,符合GT-AG剪切原则;c DNA序列包括1个1 287 bp的开放阅读框,编码428个氨基酸;在进化树上它与参与花青素调控的其他MYC蛋白聚为一簇;UV-B逆境胁迫处理下,苦荞胚轴中FtMYC基因表达量与花青素含量变化显著性相关(r=0.798,P<0.05),在子叶中则极显著相关(r=0.887,P<0.01);在4℃冷胁迫处理下苦荞胚轴中FtMYC的表达量与花青素积累没有明显的相关性(r=0.744),但在子叶中FtMYC的基因表达与花青素积累显著性相关(r=0.814,P<0.05)。此外,对FtMYC基因启动子的序列分析结果显示,pFTMYC序列包含TATA-Box和CAAT-Box等启动子核心元件以及与光、低温和胁迫应答等相关的功能元件。【结论】FtMYC基因可通过参与花青素代谢调控来参与苦荞对UV-B和寒冷等非生物胁迫的应答和适应。 相似文献
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