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【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。 相似文献
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番茄SYTA的克隆及表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根叶茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜,S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。 相似文献
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【目的】前期研究显示To MV外壳蛋白(coat protein,CP)可以与烟草蛋白L(CP-interacting protein-L,IP-L)相互作用,本研究旨在明确To MV CP与IP-L的共定位情况、IP-L的组织表达和在To MV侵染条件下烟草IP-L及其编码蛋白的表达变化情况,为进一步明确IP-L的功能提供依据。【方法】通过双酶切法从笔者实验室构建保存的p GBKT7-CP和p GADT7-IP-L重组载体上切下To MV CP和IP-L目的片段,构建融合蛋白植物表达载体p PZP-IP-L-N-EGFP和p PZP-CP-N-Ds Red及原核表达载体p EGX-IP-L。通过热激法将融合表达的植物表达载体转化至农杆菌EHA105,在烟草表皮细胞瞬时表达IP-L-N-EGFP和CP-N-Ds Red,共聚焦荧光显微镜下观察IP-L和To MV CP共定位情况。用实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)分析IP-L在本氏烟各组织部位的表达量。原核表达载体p EGX-IP-L,转化原核表达菌BL21,优化GST-IP-L可溶性表达条件后大量表达该蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-IP-L蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法明确抗体的特异性后,利用该抗体分析To MV侵染条件下番茄IP-L蛋白表达情况,用q RT-PCR检测IP-L表达变化与蛋白水平是否一致。【结果】To MV CP在本氏烟叶片表皮细胞的细胞质和细胞质膜以及叶绿体均有分布,而IP-L只在本氏烟叶片表皮细胞质膜表达,二者共定位在细胞质膜。IP-L在本氏烟叶片中特异高表达,显著高于茎、根和花中的相对表达量。在温度为30℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol·L-1条件下表达出大小为42.8 k D的可溶性GST-IP-L融合蛋白。纯化获得约4.2 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与IP-L的原核产物特异性结合。在To MV侵染本氏烟1、3、7 d后,Western印迹分析表明IP-L在叶片内表达量随接种时间呈明显上调趋势。q RT-PCR检测结果与Western印迹结果一致,显示IP-L在To MV侵染本氏烟第7天后的叶片内表达量是健康对照的3倍多,差异达到显著水平。【结论】To MV CP和IP-L共定位于本氏烟表皮细胞质膜,IP-L在本氏烟叶片内特异高表达。制备的IP-L多克隆抗体具有良好的免疫反应活性,可以用于IP-L表达量检测;To MV侵染烟草可诱导IP-L及其编码蛋白表达量显著上调。 相似文献
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番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆番茄抗性相关基因Sl Hin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sal Ⅰ和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-m GFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco Ⅰ和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv.Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因Sl Hin1,将序列分别提交至Gen Bank,得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 k D,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组10号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4 d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光。随着接种时间推移,接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 k D处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达。【结论】Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性。 相似文献
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【目的】探明茶树害虫山香圆平背粉虱不同地理种群的遗传多样性，掌握其遗传分化现状，为其科学防治提供依据。【方法】基于贵州茶园山香圆平背粉虱10个地理种群的rDNA ITS1基因序列片段，采用MEGA-X、DnaSP 5.10、Arlequin 3.5.2.2及SAMOVA 2.0等研究其种群遗传分化、基因交流、分子变异及种群遗传多样性。【结果】贵州茶园山香圆平背粉虱10个地理种群的rDNA ITS1基因序列共获得68条基因序列片段，其序列长度为434 bp,包含保守位点306个，变异位点78个，简约信息位点48个，其中9个位点发生转换，9个位点发生颠换，具有明显的G+C偏倚性；其共定义47个单倍型，包括5个共享单倍型和42个独享单倍型；总群体遗传多样性较高，表现出高单倍型多样性(Hd=0.968)和高核苷酸多样性(Pi=0.036 28);总群体遗传分化程度高(Fst=0.724 60),基因交流水平低(Nm=0.10);遗传变异主要来自组间(Fct=0.646 20);单倍型系... 相似文献
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