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对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。 相似文献
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为了持续获得大量短片段干扰RNA(short interference RNA,siRNA),通过染色体步移技术克隆得到东方粘虫U6snRNA基因5′-端侧翼启动子序列1 426bp。经生物信息学分析,该序列含SPH元件、八聚体序列(OCT)、远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)及TATA box等RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ,RNA PolⅢ)U6启动子的特征元件。通过构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体的方式,对增强型绿色荧光蛋白EGFP基因进行RNAi,证明克隆得到的东方粘虫U6启动子可成功驱动shEGFP表达,具有U6启动子功能。为后续构建以东方粘虫V-ATP酶H亚基为靶基因的沉默载体奠定基础。 相似文献
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