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番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。 相似文献
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从中蔬四号番茄品种中克隆能在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为今后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行分子育种奠定了基础。采用2轮PCR的方法,第1轮PCR从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3启动子,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,并分别构建6个截短的SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片。运用DNAMAN软件对已克隆的SlU3和拟南芥AtU3启动子序列具有转录功能的必要元件进行序列分析;经过2轮PCR,首先从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P启动子,其长度分别是1 156,1 114,1 147 bp,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,其长度依次是489,318,450,248,457,248 bp,并分别构建6个截短SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,启动子序列比对分析发现,番茄U3启动子与拟南芥U3启动子一样,也含有比较保守的2个元件,USE和TATA框,2个元件之间的位置比较固定。利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片,结果显示,成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,表明已克隆的6种不同截短番茄SlU3启动子均具有转录活性。成功克隆了6种在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑载体提供更多高效的内源启动子。 相似文献
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