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[目的]建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.[方法]根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性.[结果]制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系.优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右.采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度.2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性.[结论]基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段. 相似文献
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鲤浮肿病(carp edema virus disease,CEVD)是在锦鲤中发现的一种传染性病毒病,近年来在全球传播迅速,对鲤养殖业造成严重损害。本研究设计CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行特异性实验;选取套式PCR、荧光PCR和LAMP三种检测方法,组织10家实验室进行室间比对测试:制备含CEV病毒核酸的测试样品,评价其均匀性和稳定性,通过测试结果分析方法检出限。结果显示,套式PCR的核酸样品检测限可达6.8×10-10 g。 相似文献
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为了解进口美国种猪中获取的猪圆环病毒3型(PCV3)毒株全基因组序列及遗传变异情况,根据GenBank中收录的PCV3基因组序列,设计2对特异性引物,对确诊感染PCV3的病死猪组织进行全基因组序列扩增、拼接、测序和序列分析。结果显示,获得的PCV3美国毒株(命名为PCV3_USA2021,GenBank登录号OL799306)全基因组序列长度约为2000 bp,与国内外不同地区的38个PCV3参考毒株同源性为98.7%~99.8%。其中,PCV3_USA2021株开放阅读框ORF1和ORF2与国内外38个参考毒株同源性分别为99.1%~99.9%和98.0%~100%。构建的全基因组系统进化树显示,该毒株为PCV3a亚型,与美国毒株(PCV3-US_SD2016)亲缘关系最近。本研究为PCV3的遗传变异、流行病学分析提供了参考,也为相关疫苗的研制打下了基础。 相似文献
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