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试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。 相似文献
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试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。 相似文献
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8头泌乳中期的奶牛被随机分为2组,分别是对照组(每头牛:基础日粮+棕榈酸钙200g/d)和试验组(每头牛:基础日粮+共轭亚油酸钙200g/d),试验期14d,检测了奶产量、乳成分,分析奶牛的血液变化,并采用荧光定量PCR对乳汁体细胞中脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)的基因表达进行检测。结果显示,与对照组相比,试验组奶牛的乳产量、乳蛋白、乳糖和乳汁体细胞含量没有显著影响,但是显著降低了乳脂肪含量(P〈0.05),对照组和试验组奶牛乳脂肪含量分别为0.0326g/mL和0.0244g/mL。检测血液指标发现,共轭亚油酸钙显著升高了奶牛血液中高密度脂蛋白的含量(P〈0.05)。基因分析发现,试验组奶牛乳汁体细胞中LPL、ACA—CA的基因表达显著下调,表明共轭亚油酸钙抑制了奶牛乳腺细胞脂肪酸合成酶的基因表达。 相似文献
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不同物种的乳腺分泌物中含有的细胞成分被称为体细胞,其中包括淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞和上皮细胞。物种、乳腺感染情况、不同生理阶段和饲养管理条件等因素均会影响乳中的体细胞数量和细胞类型。近年来,乳中体细胞得到了人们的关注和深入研究,显示出广阔的应用前景。人们利用从初乳和常乳中得到的乳腺上皮细胞已经成功进行了乳腺细胞的原代培养和建立了乳腺细胞系,为乳生成、被动免疫转移和乳腺癌的研究提供了良好平台。体细胞中提取的RNA代表了乳腺组织的基因表达,因此为研究乳腺组织的基因表达提供了方便、良好的来源。 相似文献