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克隆2017年黑龙江省大庆地区流行PEDV毒株(HLJ/DQ/2017)ORF3基因,通过真核表达及分子进化分析方法,为研究ORF3蛋白生物学功能提供重要的实验基础。TRIzol裂解法提取病毒RNA,RT-PCR技术扩增ORF3基因片段并测序,克隆至p EGFP-N1载体上,转染至HeLa细胞。应用DNAStar、DNAMAN、MEGA5.0软件进行序列比对和发育树绘制,应用Western Blot技术、Immunofluorescence技术检测ORF3蛋白的表达和细胞定位。经过酶切和测序验证p EGFP-N1载体中正确插入了ORF3基因,Western Blot法、Immunofluorescence法证实ORF3-EGFP融合蛋白聚集成核表达在HeLa细胞质的局部,由进化树分析显示,该毒株和2015年黑龙江地区流行的两个株毒株(HLJ/2015/116、HLJ/2015/DP1-1)位于同一群,但相比2011年黑龙江地区爆发的毒株(CH/HLJ/HH-2/2011),前者亲缘关系更近一些。融合蛋白ORF3-EGFP在HeLa细胞中聚集成核表达,遗传进化分析表明,该毒株与2015年黑龙江省流行的PEDV毒株相比无较大变异,且为目前世界最为流行的PEDV毒株类型。 相似文献
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E蛋白是猪流行性腹泻病毒的小膜蛋白,为了研究E蛋白在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,构建了PEDV E基因的真核表达载体。通过RT-PCR技术扩增E基因片段,经双酶切连接至pEGFP-N1载体,酶切鉴定及测序结果证实PEDV E基因成功克隆到pEGFP-N1中,并将重组质粒命名为pEGFP-N1-E。将pEGFP-N1-E转染He La,利用Western Blot和免疫荧光技术检测pEGFP-N1-E的表达以及定位情况,结果显示pEGFP-N1-E在He La细胞中成功表达,并且在胞质胞核均匀分布。结果表明:pEGFP-N1-E已被成功构建,并且在He La细胞中正确表达。为后续研究关于E基因的功能及其在抗病毒中所发挥的作用等方面奠定了研究基础。 相似文献
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美洲大蠊(Periplaneta americana)是一种富含蛋白质、脂肪和生物活性成分的昆虫蛋白来源,具有成为鱼粉替代源的潜力。选取初始体质量约3 g的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)幼鱼为研究对象,采用美洲大蠊粉分别替代0%、50%鱼粉配制的2种等氮等能饲料,持续投喂18周,探究了美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生长、生化指标、抗病力及代谢组学的影响。养殖实验结束后,采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对剩余虹鳟幼鱼进行攻毒实验。结果表明：实验组幼鱼生长性能及攻毒后成活率均显著高于对照组(P<0.05);实验组幼鱼血清中免疫球蛋白(IgM)、总抗氧化能力(T-AOC)、肝脏中溶菌酶(LZM)和头肾中过氧化氢酶(CAT)活性均显著高于对照组(P<0.05);代谢组学分析结果显示,两组血清中的差异代谢物主要参与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等8条生化代谢途径,其中参与甘油磷脂代谢的溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)和磷脂酰胆碱(PC)含量均在实验组显著上调。综上,采用美洲大蠊粉替代饲料中50%的鱼粉可显著提高虹鳟幼鱼... 相似文献
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肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,肠道病毒属,肠道病毒A型的成员,是引起婴幼儿手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的一种重要病原病毒。但截至目前,EV71病毒与宿主细胞相互作用的机制仍不清楚。为了研究EV71病毒诱导应激颗粒形成的分子机制,研究首先构建了真核表达载体pDsRed2-G3BP1,随后构建了稳定表达融合蛋白RFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系(HeLaRFP-G3BP1),并应用Western Blot和免疫荧光技术证实了G3BP1融合蛋白的正确表达。EV71病毒感染HeLaRFP-G3BP1后,超过40%感染细胞的胞质中出现了应激颗粒。此外,应用微管特异性抑制剂破坏细胞微管完整性之后,显著抑制应激颗粒的迁移聚集。研究证明了EV71病毒诱导细胞应激颗粒的初步形成并且应激颗粒的迁移聚集依赖于微管的完整性。 相似文献
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