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为研究大黄鱼肿瘤抑制因子cylindromatosis（CYLD）在免疫反应中的作用,本实验克隆了大黄鱼CYLD的全长cDNA（命名为LcCYLD）并对其进行序列分析;采用荧光定量PCR的方法对大黄鱼各组织及免疫刺激后的大黄鱼肾细胞系中的LcCY LD表达变化进行检测;构建了重组表达载体pTurboGFP-CYLD及pcDNA3.1-CYLD,分别用于亚细胞定位实验及过表达实验;在HEK293T细胞系中过表达LcCYLD后采用双荧光素酶报告系统检测了 NF-κB、TNF-α及IL-1β 启动子活性的变化。结果显示,LcCYLD的ORF包含2 754 bp,编码917个氨基酸,推测具有保守的3个N端的CAP-GLY结构域,1个磷酸化区域和1个C端的UCH结构域,多序列比对结果显示各物种CYLD间高度保守;系统进化分析显示,LcCYLD与来源于其他硬骨鱼的CYLD聚为一支,其中与条纹鲈的CYLD关系最近;转录水平表达分析发现LcCYLD在大黄鱼各组织均有表达,其中在脑中表达量最高;LPS及poly I:C刺激能够显著诱导LcCYLD的表达;亚细胞定位实验表明LcCYLD在细胞质及细胞核中均有表达;过表达LcCYLD能够显著抑制NF-κB及促炎细胞因子TNF-α及IL-1β的转录激活。以上研究结果表明大黄鱼CYLD能够抑制NF-κB的转录激活,为深入了解LcCYLD在大黄鱼先天免疫信号转导中的作用奠定基础。 相似文献
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为研究大黄鱼双免疫球蛋白白细胞介素1受体相关分子 (double immunoglobulin interleukin-1 receptor-related molecule, DIGIRR) 在免疫反应中的作用,本实验克隆了大黄鱼DIGIRR (LcDIGIRR) 的编码区序列;采用荧光定量PCR (qPCR) 对大黄鱼各组织及免疫刺激后的脾脏、头肾等组织及大黄鱼肾细胞系 (LCK) 中的LcDIGIRR表达情况进行了检测;构建了重组表达质粒pTurboGFP-DIGIRR及pcDNA3.1-DIGIRR,分别以绿色荧光蛋白 (GFP) 为报告基因及双荧光素酶报告系统,研究了LcDIGIRR的亚细胞定位及过表达后对NF-κB启动子活性的调控。结果显示,LcDIGIRR的开放读码框 (ORF) 包含1575 bp核苷酸,编码 524 个氨基酸,理论分子量为59.4kDa、等电点 (pI) 为5.76,N端包含2个免疫球蛋白 (Ig) 结构域,1个跨膜区及1个Toll/白细胞介素-1受体 (TIR) 结构域,属于保守的硬骨鱼类DIGIRR家族;qPCR分析表明LcDIGIRR在大黄鱼多组织均有表达,其中在肠道中表达量最高;采用变形假单胞菌 (Pseudomonas plecoglossicida) 及脂多糖 (LPS)、鞭毛蛋白、多聚肌-胞苷酸 [poly (I:C)]等分别进行体内与体外刺激,均可诱导其表达量显著增加 (P < 0.05);亚细胞定位结果显示LcDIGIRR主要存在于细胞的膜质区;过表达LcDIGIRR能够显著抑制NF-κB及MyD88介导的NF-κB的转录激活 (P < 0.05)。以上结果表明LcDIGIRR可能通过抑制NF-κB的转录激活,在大黄鱼的免疫反应中发挥负调控作用。 相似文献
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