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为探究重组小麦(Triticum turgidum)Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)抑制活性特征及其对鲢鱼肌原纤维蛋白自溶反应的抑制效果,采用TA克隆技术克隆小麦BBI成熟肽基因片段,并对原核表达的小麦BBI蛋白进行镍亲和层析纯化,利用SDS-PAGE、TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果。在测定重组小麦BBI对胰蛋白酶的抑制活性的基础上,进一步通过SDS-PAGE分析了重组BBI对鲢鱼肌原纤维蛋白自溶反应的抑制作用。结果表明,经双酶切鉴定证实成功获得了BBI成熟肽基因片段,该基因与野生二粒小麦BBI相关基因(GenBank登录号EU346892.1)序列相似性为99.63%。目的蛋白在SDSPAGE及TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱分析中,分别表现为单一带和单一峰,产物得到有效纯化,分子量约10.5kD。该重组小麦BBI对胰蛋白酶有明显的抑制活性。添加量5μg·mg-1重组BBI可显著抑制鲢鱼肌原纤维蛋白(尤其是肌球蛋白重链)在pH 7.5,50℃下的自溶。 相似文献
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文章克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Stefin c DNA全长序列,全长294 bp,编码97个氨基酸,无二硫键,N端存在高度保守的Gly(3、4)残基及QXVXG(45~49)序列,比对结果显示其氨基酸序列与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)Stefin A1一致性最高,为47.5%。进化树分析表明草鱼Stefin A与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)、southern platyfish(Xiphophorus maculatus)、Colisa chuna(Trichogaster chuna)、lamprologini(Neolamprologus brichard)、elephant shark(Callorhinchus milii)及bicolor damselfish(Stegastes partitus)Stefin A聚为一类。将构建的原核表达载体Stefin-Pet30a转入E.coli BL21,以1 mol·L-1IPTG诱导表达重组Stefin蛋白,而后经梯度尿素洗涤和镍亲和层析纯化,并分别利用SDS-PAGE和TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果,SDS-PAGE结果显示重组Stefin蛋白得到高度纯化,最终呈现相对分子量11.4 k D的单一条带;其在高效液相上保留时间25.98 min处亦呈单一活性峰,纯度为96.28%。以荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)测活法鉴定重组草鱼Stefin对鲤鱼组织蛋白酶B、L的抑制活性,发现该重组蛋白对二者均体现了明显的抑制活性。 相似文献
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