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研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450 nm值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。 相似文献
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为了调查新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的原因并确定病原,无菌采集15份腹泻犊牛粪样进行病原的分离培养,采用形态学观察、生化试验、血清学和致病性分析等方法鉴定分离菌株,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物进行基因序列扩增并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的其他菌株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树并进行分析,同时对分离菌株的黏附性基因进行鉴定。结果从15份样品中分离获得2株分离菌株;试验显示,分离株均发酵葡萄糖,MR试验、吲哚和甲基红试验呈阳性,硫化氢、氧化酶、DNA酶、VP试验呈阴性。2株分离菌株血清型均为O78,且均具有致病性。药敏试验显示,分离菌株均对环丙沙星、卡那霉素、氟哌酸、庆大霉素、磺胺甲唑、头孢哌酮、壮观霉素、多黏菌素B、呋喃妥因敏感。分离株16S rRNA基因序列与大肠杆菌菌株NF738(GenBank登录号:MT649856)同源性为≥99.7%,且处于同一大分支。经PCR鉴定,分离菌株具有K88黏附性基因。本研究结果证实了引起新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的病原为致病性产肠毒素型大肠杆菌。 相似文献
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社会主义新农村建设是我们党目前农村工作的重中之重,建设社会主义新农村的核心是提高农民切身利益,解决农民切身利益的关键是如何帮助农民增加收入的问题。而农业产业化是农民增收的有效途径。在推进农业产业化进程中,农村专业合作经济组织有着不可替代的重要作用。从近年来内 相似文献
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细菌"活的非可培养状态"(Viable but non-culturable state,VBNC)自80年代徐怀恕等人提出以来,引起了微生物学各领域的极大关注,这不仅为环境中微生物多样性的发展提供了新的线索,而且对预防兽医学,疫病流行病学及公共卫生学等方面具有重要的意义. 相似文献
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评价某国产和某进口猪支原体肺炎灭活疫苗在新疆规模猪场的田间免疫效果,为规模化猪场合理选择疫苗提供数据参考。选择新疆某规模化养猪场猪只1 832头,随机分为3组,分别是国产疫苗组 （第Ⅰ组）、进口疫苗组 （第Ⅱ组）和对照组 （第Ⅲ组）,记录疫苗免疫后猪只的临床症状、成活率、日增重、屠宰肺部病变评分等指标,进行免疫效果评价。结果显示：国产和进口2种疫苗的安全性均良好,注射部位无红、肿等不良反应,免疫猪只的精神和食欲正常。免疫组仔猪平均咳嗽次数较对照组明显减少,差异显著 （pagenumber_ebook=81,pagenumber_book=79＜0.05）,但是国产疫苗组和进口疫苗组2个免疫组之间差异不显著 （pagenumber_ebook=81,pagenumber_book=79＞0.05）;国产疫苗组、进口疫苗组仔猪成活率分别为91.80%、91.20%,对照组仔猪成活率为89.20%;国产疫苗组、进口疫苗组仔猪的日增重分别比对照组高39 g、32 g;国产疫苗组、进口疫苗组和对照组猪的肺部病变评分分别为3.05±1.05、3.65±1.04和6.87±2.12,免疫组与对照组差异显著 （pagenumber_ebook=81,pagenumber_book=79＜0.05）,但免疫组之间差异不显著 （pagenumber_ebook=81,pagenumber_book=79＞0.05）。某国产和某进口猪支原体肺炎灭活疫苗安全性和免疫效果相当。 相似文献
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