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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制奠定基础。将类NADC30毒株CHsx1401全长基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,分别将扩增片段克隆到pJET1.2载体构建中间质粒,将4个克隆依次连接并克隆到改造后的低拷贝质粒载体pWSK29中,构建全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,并在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入AscⅠ酶切位点,作为遗传标记,用于区分拯救病毒与亲本病毒。采用脂质体LTX将全长cDNA克隆质粒转染至MARC-145细胞拯救病毒。结果表明,成功构建出全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,转染MARC-145细胞后传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,从全长cDNA克隆可拯救出病毒。拯救病毒(RvCHsx1401)在MARC-145细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似,在MARC-145细胞上各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。本研究构建的类NADC30毒株CHsx1401的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;拯救病毒与亲本病毒的体外增殖特性相似,为研究该毒株的变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制提供了技术平台。 相似文献
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