巴泰病毒G1189aa-239aa肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立     

员晓庆  李丽霞  唐甜  陈盛楠  梁晓彤  黄良宗  司兴奎  张浩吉  孙秀涛  段文学  金宁一  刘昊 《中国畜牧兽医》2021,48(10):3770-3778

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒（Batai virus,BATV） G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189－239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_189aa-239aa,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_189aa-239aa肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_189aa-239aa肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_189aa-239aa肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段特异性较好。以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5 μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10 000。样品D_{450 nm}值≥0.367为阳性,D_{450 nm}值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1 600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_189aa-239aa肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。  相似文献   

巴泰病毒N5aa-90aa重组肽段的原核表达纯化及多克隆抗体的制备     

唐甜  李丽霞  员晓庆  梁晓彤  陈盛楠  黄良宗  杨秋艳  陈永  金宁一  刘昊 《中国动物传染病学报》2023,(5):194-201

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科成员,其核衣壳N蛋白具有高度保守性,可诱导机体产生较好的抗体反应,常用做诊断抗原。本研究通过对N蛋白强抗原性肽段N_5aa-90aa进行密码子优化,将其插入到p ET-32a(+)载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,通过不同IPTG浓度和诱导时间确定最佳蛋白表达条件。利用镍柱亲和层析方法对r His-N_5aa-90aa肽段进行纯化。通过Western blot对r His-N_5aa-90aa肽段进行验证,将r His-N_5aa-90aa肽段免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价。结果显示：本研究成功构建了p ET-32a-N_5aa-90aa重组质粒,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、37℃诱导5 h可获得大量重组蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示重组r His-N_5aa-90aa肽段分子质量约28.6 kDa,蛋白浓度为0.256 mg/mL;经Western...  相似文献