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为建立创伤弧菌的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法,根据编码创伤弧菌DNA促旋酶的B亚单位蛋白(Gyrase Beta Subunit,gryB)的基因保守序列,设计RPA特异性引物,建立创伤弧菌gryB基因的RPA检测方法并测试其特异性、灵敏度和应用效果。结果发现,建立的RPA检测方法特异性好,能够从创伤弧菌中检测到234 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40 min,不需要特殊的仪器设备;该方法的灵敏度与PCR相当,可达到0.1 ng/μL,应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当。因此,本研究建立的RPA方法检测gryB特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室快速检测。 相似文献
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Taqman-LNA荧光PCR快速检测肉制品中马源性成分的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立快速检测肉制品中马源性成分的Taqman-LNA荧光PCR方法。[方法]基于马的种属保守序列,设计特异性引物和Taqman-LNA探针,建立可快速检测肉制品中马源性成分的Taqman-LNA荧光PCR检测方法。通过对特异性、灵敏度、重复性的检测,对建立的方法进行评价。[结果]建立的Taqman-LNA荧光PCR方法灵敏,可检测到马肉DNA最低限为1.4 pg;特异,与猪、牛、羊、鹿、驴、兔、鸡、鸭、鹅、虾无非特异性反应;可重复,批内和批间的变异系数均小于2%;准确,应用该法检测人为掺入马肉的肉制品,检测结果与预期相符。[结论]本研究建立的方法具有灵敏度高,特异性强,重复性好等优点,适合于肉制品中马源性成分检测。 相似文献
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【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。 相似文献
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