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【目的】对山羊干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)的CDS区进行克隆、表达和生物信息学分析,并探讨小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染山羊子宫内膜上皮细胞(caprine endometrial epithelial cells,EEC)对ISG15的影响。【方法】根据GenBank中公布的山羊ISG15基因预测序列(登录号:XM_005690795)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增山羊ISG15基因CDS区,连接至真核表达载体进行测序并表达,对不同物种ISG15核苷酸及氨基酸序列进行比对,并构建系统进化树,利用生物信息学方法对ISG15蛋白理化性质、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、亚细胞定位等进行分析。通过构建真核表达载体转染及PPRV感染EEC细胞,利用间接免疫荧光的方法观察其外源性和内源性亚细胞定位,并探究PPRV感染对EEC细胞的影响。【结果】成功克隆出山羊ISG15基因CDS区并进行了真核表达。山羊ISG15核苷酸和氨基酸相似性及进化树分析都与盘羊和绵羊亲缘关系最近。生物信息学分析结果显示,山羊ISG15基因位于16号染色体上,全长474 bp,编码157个氨基酸,分子质量约为17.47 ku,为亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,有1个潜在的N-糖基化位点,16个潜在的O-糖基化位点和10个潜在的磷酸化位点。二级结构与三级结构预测显示,山羊ISG15蛋白由无规则卷曲、延伸链、α-螺旋和β-转角组成,比例分别为34.39%、31.21%、21.66%和12.74%。可以与干扰素和泛素化相关的蛋白相互作用,并参与机体的抗感染作用。亚细胞定位显示,外源性和内源性ISG15均定位于细胞质中。【结论】试验成功克隆出山羊ISG15基因CDS区序列,亚细胞定位发现内源性和外源性ISG15均定位于EEC细胞的细胞质中。结果为后续ISG15基因细胞内功能研究奠定基础。 相似文献
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将山羊的BST-2基因 (Capra hircus bone marrow stromal antigen 2 gene)分别克隆至原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3×Flag-CMV-14中,获得了重组表达质粒pGEX-BST-2和p3×Flag-BST-2。将重组质粒pGEX-BST-2转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot结果显示,诱导表达的重组蛋白分子量约为42 ku,与预期蛋白一致。利用脂质体介导转染法将重组质粒p3×Flag-BST-2转染Vero细胞,经激光共聚焦显微镜检测,结果显示,BST-2蛋白在细胞中可以良好表达,并主要定位于细胞膜上。 相似文献
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