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为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID50)。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明：试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;... 相似文献
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猪宿主蛋白G3BP1在宿主抵抗病毒感染过程中起着重要作用,然而还未有相关报道G3BP1与猪圆环病毒2型(PCV2)感染过程中的联系。本文构建了G3BP1真核表达载体和干扰RNA,实现在PK15细胞上G3BP1的过表达及敲低。结果发现,PCV2感染细胞24 h后病毒复制出现显著差异,感染48 h相比于感染24 h病毒复制差异更显著,表明G3BP1能显著促进PCV2复制。过表达或敲低G3BP1后,用干扰素刺激DNA(ISD)刺激12 h,G3BP1能促进ISD诱导IFN-βmRNA的表达;感染PCV212 h后,G3BP1也能正调控IFN-βmRNA的转录。本文揭示了宿主蛋白G3BP1显著促进PCV2的复制,很可能是通过上调IFN-β表达引起的。 相似文献
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为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现... 相似文献
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